До вашої уваги – ще один матеріал від авторів науково-популярного порталу «Моя наука» у нашій новій рубриці «Дивовижний світ науки». Портал створений для того, щоб з'являлося більше зрозумілих та якісних текстів українською мовою про наукові досягнення та відкриття, про українських дослідників. Тому й автори цієї рубрики – українські науковці у галузі біології та медицини.

 

 

У нашій рубриці ми регулярно звертаємося до центрального питання біології розвитку – дива перетворення в утробі матері заплідненої яйцеклітини на мільйони клітин: спочатку однакових, а потім різноманітних. Тотіпотентність перших двох-чотирьох клітин швидко зникає, замінюється плюрипотентністю. Цікаво, що у ссавців тотіпотентність зберігається переважно для перших двох бластомерів, у низки видів (вочевидь, і в людини) – для чотирьох, і тільки у броненосців можлива для восьми перших клітин. Тотіпотентна клітина здатна дати початок цілому організму, інші стовбурові та звичайні соматичні клітини на це не здатні

 

 

Плюрипотентність – це теж непогано. Плюрипотентна клітина здатна перетворитися на багато-багато різних типів клітин. Але на певному етапі ембріогенезу плюрипотентність теж закінчується. У дорослому організмі залишаються лише мультипотентні клітини – прогенітори. Деякі з них здатні диференціюватися лише у декілька типів клітин, як наприклад, прогеніторні клітини підшлункової залози, але інші можуть давати цілу купу різноманітних нащадків, що характерно для клітин строми кісткового мозку. Кожна з таких клітин має гілки нащадків, на кінцях яких знаходяться уніпотентні клітини – клітини-попередники, «-бласти». Еритробласти, лімфобласти, остеобласти можуть диференціюватися тільки у свій тип клітин – відповідно еритроцити, лімфоцити, остеоцити.

Отже, кожний тип клітин має свої особливості, функції, набір білків. Якщо вже розбиратись зовсім до кінця, то й кожна клітина нашого організму унікальна, зі своєю унікальною долею, набором соматичних мутацій, поверхневих антигенів, рівнем експресії генів тощо. Недарма останні успіхи в удосконаленні технологій секвенування геному людини призвели до появи цілої нової галузі клітинної біології – дослідження окремих клітин (ми писали про це більш детально в статті про Клітинний атлас у ЗТЖ №1/2019).

Але повернімось на рівень вище, до відмінностей між типами клітин у різних тканинах. Всі клітини організму беруть початок від яйціклітини, що має певний набір генів, а вже всього за півроку ми маємо десятки типів клітин, що засновані на майже такому самому генетичному коді. Як це відбувається?

Розмірковуючи на цю тему у догеномну епоху (тобто тоді, коли вчені не вміли швидко прочитувати послідовності нуклеотидів у десятках, а то й тисячах генів та інших послідовностей ДНК) британський біолог Конрад Воддінгтон прийшов до висновку, що по мірі розвитку кожна з клітин рухається у часі за певною траєкторією, як кулька з гори по жолобу. Цю траєкторію Воддінгтон назвав «креодом», а умовний простір, в якому відбувається розвиток клітини – «епігенетичним ландшафтом».

«Епігенетичний» у перекладі – «над генетичним». Тобто це всі впливи на клітину, які здійснюються, не змінюючи її генетичну інформацію, проте призводять до зміни її функції – диференціації. Воддінгтон став таким чином творцем нової науки – епігенетики.

Сьогодні, через півстоліття після праць британця, ми знаємо, що являють собою ці епігенетичні обмеження, які рухають клітину по її креоду. Це хімічні мітки на ДНК клітини, а також на гістонах – білках, на які намотана довга подвійна спіраль ДНК. Ми трохи писали про це в статті про клонування приматів у нашій рубриці в одному з попередніх номерів (див. ЗТЖ №6/2018), але незайвим буде пояснити це у контексті диференціації клітин.

На цитозинових нуклеотидах ДНК спеціальний фермент виставляє мітку – невеличку метильну групу, CH3. Однієї цієї зміни виявляється достатньо, щоб система зчитування генів, клітинна машина транскрипції працювала з меншим ентузіазмом. А якщо декілька цитозинів на початку гену отримують метильну модифікацію, то ген може припинити роботу взагалі, замовкнути. Зупиняється синтез матричної РНК з нього, не утворюється кодований ним білок.

Інформацію про цю втрату активності гену сигнальні білки передають до гістонів. Гістони зібрані в своєрідні діжечки, з яких назовні звисають білкові хвости. ДНК – це дезоксирибонуклеїнова кислота, а кислоти заряджені негативно. Тому гістонові білки мають позитивний сумарний заряд: щоб ДНК притягувалася до їхніх конгломератів. А ось хімічні модифікації хвостів можуть змінювати цей заряд. Якщо до білків додається негативно заряджена група, то гістони стають більш нейтральними, не так сильно тримають ДНК, дозволяють їй розкрутитися. Тоді як позитивно заряджені або нейтральні групи сприяють більш тісній взаємодії між гістонами та генами. Звісно, що в більш тісну, більш скручену структуру ДНК важче пролізти ферментам, які забезпечують роботу генів – і гени «замовкають».

Тепер повернімося до долі окремої клітини під час ембріогенезу. Зараз у загальних рисах зрозуміло, що зміни в її функціонуванні пов’язані з епігенетичними процесами. Коли запліднена яйцеклітина дробиться на бластомери, її ДНК ще майже неактивна, всі потрібні для першого десятку поділів білки утворюються з мРНК, яку запасено ще з часів гаметогенезу в яєчниках жінки.

А от далі вже вмикається ядерний геном. І тут одразу діють епігенетичні фактори, тобто певні зовнішні сигнали, які впливають на зміну епігенетичних міток на ДНК та гістонів. Насправді, такими факторами може бути чи не все, що завгодно: температура, тиск, поверхня сусідньої клітини, сигнальні молекули, світло, рух іонів – навіть те, що ми бачимо й чуємо. Так, наші відчуття й пам’ять також є епігенетичними факторами, які змінюють хімічні модифікації на молекулах у клітинному ядрі. Звісно, в зародка на стадії кількох сотень клітин немає спогадів, а епігенетичні зміни в цих клітинах викликають здебільшого сигнальні молекули, які виділяються сусідніми клітинами.

По мірі зміни клітинного оточення змінюється епігенетичний статус клітини. Поступово стають усе менш активними – з метильованими цитозинами та туго закрученою на гістонах ДНК – гени, які відповідають за неконтрольований поділ клітини та потенціал перетворюватися на інші типи клітин. Натомість «вмикаються» ті гени, що є характерними для клітин певної тканини: наприклад, нервової чи епітеліальної. Така клітина стає лише мультипотентною.

Далі епігенетичні обмеження стають ще більш жорсткими, й клітина перетворюється на бласт-попередник, що дає початок лише одному типу клітин. Подальший розвиток попередника остаточно блокує йому можливості розвиватися в інші напрямки, проте епігенетичні мітки знімаються з генів, що відповідають за необхідні для цієї клітини функції. Клітина остаточно диференціюється для своєї фізіологічної задачі.

Уже перші ознаки розуміння цього складного процесу (а до повного розуміння навіть сьогодні дуже далеко!) народили й доволі очевидну ідею: а що, як кульку погнати по креоду назад, зняти епігенетичні обмеження, запустити клітину в протилежний бік розвитку, до дедиференціації? Іншими словами, зі звичайних соматичних спеціалізованих клітин отримати стовбурові клітини, якими б можна було б «залатати дірки» у дорослої людини, вилікувати невиліковні хвороби. Адже досі людство могло використовувати тільки ембріональні стовбурові клітини з зародків, що зі зрозумілих причин порушує прийняті етичні норми.

До вирішення проблеми найближче підійшов японський біолог Сінья Яманака. У 2000-х роках він виявив білки, що активні саме в ембріональних стовбурових клітинах. Це були транскрипційні фактори – якраз ті молекули, що можуть змінювати епігенетичний статус багатьох генів: запускати роботу одних і примушувати замовкнути інші. Яманака спробував штучно вводити гени цих транскрипційних факторів у звичайні клітини за допомогою вірусних векторів.

Сталося передбачуване теорією, але при цьому все одно фантастичне на практиці: клітини почали перетворюватися на стовбурові!

Експериментуючи далі з різними генами, Яманака зміг підібрати найменшу комбінацію транскрипційних факторів, потрібних для ключового перетворення. Їх чотири, та вони стали відомими й увійшли до підручників як «фактори Яманака»: OCT4, c-MYC, SOX2, KLF4 [1].

Отримані клітини стали називати індукованими плюрипотентними стовбуровими клітинами (ІПСК). Сінья Яманака 2012 року отримав Нобелівську премію з фізіології або медицини.

Надалі були спроби ще спростити цю схему. Одна з них закінчилася трагічно. Японська дослідниця Харукі Обоката 2014 року опублікувала у найпрестижнішому науковому журналі «Nature» статтю, у якій заявила про новий спосіб перетворення клітин шкіри на ІПСК. Нібито певні стресові фактори, як-то бактеріальні токсини чи короткотривалий вплив кислоти, без всіляких ін’єкцій додаткових генів здатні перетворити клітини на стовбурові.

Публікація викликала фурор, і десятки лабораторій по всьому світі взялися спробувати нову методику, що обіцяла дешевий і швидкий результат. На жаль, це нікому не вдалося, і з’явилися підозри. За півроку було проведене розслідування, яке виявило фальсифікації у роботі дослідниці. Обоката була позбавлена роботи та вченого ступеня, а її керівник, не витримавши ганьби, наклав на себе руки [2]. Ціна інтелектуальної нечесності в науці висока, тому покарання за неї теж має бути невідкладним.

Втім отримати плюрипотенті клітини – це пів справи. Тепер потрібно диференціювати їх у тому напрямку, який потрібен лікарю чи досліднику. В ембріогенезі це відбувається легко, ніби саме собою: клітина знаходиться в оточенні інших «потрібних» клітин, які виділяють необхідні для її диференціації епігенетичні фактори. У пробірці чи у дорослому організмі таких умов немає. Тому тепер розвиток ІПСК потрібно запустити у звичному напрямку диференціації. А тут уже сотні варіантів транскрипційних факторів та інших регуляторних молекул, які призведуть до перетворення їх на клітини серця, печінки чи інших органів.

Більше того, щоб використовувати такі отримані з ІПСК спеціалізовані клітини, потрібно дуже добре пересвідчитися, чи вони відповідають нормальним клітинам, що розвинулися у звичайний спосіб. Цьому напрямку присвячені численні дослідження вже у наші дні.

А поки нема впевненості, що похідні від ІПСК кардіоміоцити чи гепатоцити можна пересадити хворому на інфаркт чи цироз, такі клітини все одно вже поставлені на службу медичної науки. Їх вирощують в лабораторіях, щоб дізнатися, як працюють клітини тих пацієнтів, які страждають на невиліковні захворювання. Можна взяти біопсію легені чи кишечника, але зазвичай важко (й небезпечно для пацієнта) відділити шматок тканини від серця чи мозочка. Тому вирощені з фібробластів шкіри нейрони та кардіоміоцити можна виростити в культурі клітин, дослідити їхні вади в пацієнтів зі спадковими порушеннями роботи цих клітин, підібрати препарати, що дозволяють зменшити наслідки цих порушень.

Більше того, можна зібрати такі штучно індуковані нейрони та культивувати спеціальним методом – і отримати структуру, яка нагадує маленьку кору головного мозку, органоїд. Це відкриває можливості для вивчення тих деталей роботи нейронних мереж, які в людини відрізняються від модельних тварин (мишей, собак, макак) і які були недоступні науковому пізнанню ще декілька років тому.

І все-таки шлях дедиференціації соматичних клітин до ІПСК, а потім їхньої диференціації довгий і витратний. Науковці весь час шукають способи знайти простіший варіант. У 2011 році група дослідників з Каліфорнії виявила спосіб перетворення фібробластів шкіри на нейрони без стадії індукованих стовбурових клітин. Якщо додати до стандартних факторів нейрогенезу 2 мікроРНК – короткі регуляторні молекули РНК, які оркеструють роботою одразу десятків генів – то на виході з’являються клітини, на вигляд дуже схожі на нейрони, з характерними для нервових клітин фізіологічними відповідями. Звісно, самі нейрони дуже різні, тому це знов-таки ще не готові для пересадження пацієнту клітини, але перспективний початок шляху в цьому напрямі. Приємно, що серед основних авторів цього дослідження – наш співвітчизник, Олександр Щегловітов, нині професор-асистент в Університеті штату Юта [3].

А чи можна ще простіше? Можна, – переконує вже багато років професор Майкл Левін з Університету Тафта в Бостоні. Оці всі ваші гени, епігенетичні мітки, транскрипційні фактори, мікроРНК, окремі клітини – це все дуже добре. Але є способи впливати на всі ці ланки організму одночасно. Нам допоможе біоелектрика, запевняє Левін. Дійсно, електромагнітні поля генеруються окремими молекулами (пам’ятаєте про електричний заряд ДНК та білків?), мембраною ядра, кожною клітиною, їхніми ансамблями, цілими органами (електроенцефалограму та електрокардіограму робили більшості наших читачів). Електричне поле є потужним епігенетичним фактором: саме зміни зарядів на різних боках клітинної мембрани призводять до епігенетичних модифікацій у ядрі нейронів, які ми сьогодні пов’язуємо з пам’яттю. Якось електрика діє й на інші частини організму, хоча тема не настільки гарно вивчена, щоб одразу бігти й купувати сумнівні електростимулятори, які шарлатани від електротерапії вже сконструювали у великих кількостях.

Проте попри скепсис та надлишок псевдонаукових концепцій навколо цієї теми, реальні експериментальні результати лабораторії Левіна та його колег приголомшують і надихають. Зокрема, дослід з відрізаною кінцівкою дорослої шпоркової жаби. У жаб регенерація дуже добре розвинена на стадії пуголовків, але значно слабша у дорослих особин: пошкоджена лапа загоюється, але нова не відростає. Дослідники вигадали дуже простий експеримент. Вони звернули увагу, що мембранний електричний потенціал стовбурових клітин більш позитивний, аніж у звичайних соматичних. А що як примусити позитивні іони натрію заходити в клітину, чи це не примусить її  дедиференціюватися? Обробивши лапу жаби іонофором – спеціальною молекулою, що здатна проносити іони через непроникну для них ліпідну (жирну, гідрофобну) мембрану – разом з натрієм, вони вже за декілька днів побачили наявність у тканині характерних для стовбурових клітин білків. А за декілька тижнів у жаби почали формуватися схожі на пальці відростки!

Земноводні все ж влаштовані на генетичному й епігенетичному рівні інакше, аніж ссавці (див. той же ЗТЖ №6/2018), тому поки подібним способом лікувати людину не вийде. Проте цей дослід доводить, що необов’язково йти через генетичну модифікацію чи трансформацію, можливо знайти й комбінації негенетичних факторів, що дозволять розширити можливості регенерації та оновлення нашого організму в дорослому віці. Різні способи, різні підходи ведуть нас до однієї важливої мети – поліпшення якості життя та подовження його активної частині. Досягти її може тільки сучасна наука, яку й потрібно підтримувати всіма силами суспільства.