Аналіз таргетних регіонів геному позаклітинної ДНК у материнській плазмі крові для неінвазивного пренатального тестування на трисоміЇ 13,18, 21, та для визначення статі плода (ЧАСТИНА ІІ)

Результати

Всього у цьому сліпому дослідженні було проаналізовано 631 зразок плазми крові жінок, яким були проведені інвазивні маніпуляції, в тому числі 52 вагітних із Т21, 16 – Т18 і 5 – Т13 (Рис. 1). Один зразок не пройшов контроль якості бібліотеки секвенування і був виключений з аналізу. Ще 19 зразків (14 нормальних, 3 Т18, 2 Т13) мали недостатню фракцію вфДНК <4% і були виключені з аналізу. На Рис. 2 показані демографічні характеристики усіх 631 зразків. Медіана віку матері склала 36 років, медіана маси тіла матері – 63 кг, а медіана гестаційного віку – 16 тижнів. Усі 611 зразків, які відповідали усім критеріям контролю якості, отримали певний показник ризику трисомії для Т21, Т18 та Т13 (Рис. 3). Зразки з показником ризику, вищим за порогове значення 1, були віднесені до категорії трисомії.

Апостеріорний аналіз валідованого набору даних свідчить, що цей поріг може бути навіть на рівні 0,91 (див. Рис. 1). Детекція Т21 відбулася в 52/52 випадках (95% ДІ, 93,2–100%) (Рис. 3А). Детекція Т18 відбулася в 16/16 випадках (95% ДІ, 79,4–100%) (Рис. 3В) і детекція Т13 відбулася в 5/5 випадках (95% ДІ, 47,8–100%) (Рис. 3С). Ці результати представлені у Табл. 1.

З розподілом усіх випадків за фетальною фракцією можна ознайомитися на Рис. 2. Середнє арифметичне усіх фетальних фракцій склало 10,9% із SD 4,1%. Як показано на Рис. 4, зв’язку між фетальною фракцією та ризиком трисомії в нормальних зразках немає (р-значення кореляції Пірсона ˃0,4 для усіх 3 тестів анеуплоїдії), хоча у зразках з трисомією спостерігалась чітка кореляція цих показників. А саме показник кореляції Пірсона, що оцінює зв’язок між ризиком трисомії та фетальною фракцією у зразках із Т21, Т18 та Т13, дав р-значення 0,0014, 0,0002 та 0,0164 відповідно.

Дев’ятнадцять зразків з аналізу виключено з причини низької фетальної фракції, ще 1 зразок виключено з технічних причин. Із 611 зразків, які залишилися, 538 – норма, 52 – Т21, 16 – Т18 та 5 – Т13.

Нижня та верхня частини кожного «ящичка» становить собою міжквартильний діапазон (IQR) певної характеристики, а смуга посередині – значення медіани. «Вуса» кожного «ящичка» показують діапазон даних,що знаходяться в межах 1,5хIQR. Значення, вищі ніж 1,5хIQR, показані незаповненими кружечками.

Випадки Т21 (А), випадки Т18 (В) та випадки Т13 (С). Зразки без патології (норма) позначені незаповненими кружечками, з трисомією – кружечками чорного кольору.

Випадки Т21 (А), випадки Т18 (В) та випадки Т13 (С). Зразки без патології (норма) із достатньою фетальною фракцією позначені незаповненими кружечками, а зразки без патології з недостатньою для аналізу (<4%) фетальною фракцією – незаповненими квадратами. Зразки з трисомією з достатньою для аналізу фетальною фракцією показані кружечками чорного кольору, а зразки з трисомією з недостатньою для аналізу фетальною фракцією (<4%) – квадратами чорного кольору. Лінія найкращої відповідності демонструє відсутність зв’язку між показником ризику трисомії та фетальною фракцією для зразків норми та, навпаки, наявність такого зв’язку між показником ризику трисомії та фетальною фракцією для зразків з трисомією.

Обговорення

У цьому дослідженні застосовано таргетний метод на основі захоплення таргетних послідовностей, а також інноваційні аналітичні алгоритми для детекції трисомій 21, 18 та 13 у плода. У рамках сліпого валідаційного дослідження, до якого увійшло 631 вагітна жінка з терміном гестації принаймні 10 тижнів, була продемонстрована 100%-ва діагностична чутливість та специфічність і точно визначені 52/52 випадки Т21, 16/16 випадків Т18 та 5/5 випадків Т13 у тих зразках, які відповідали критеріям контролю якості (n=611). Цей тест також правильно визначив стать плоду в усіх випадках.

У даному дослідженні ми зосередили увагу на аналізі хромосом 21, 18 та 13 та визначили, що оптимізований набір із приблизно 1500 локусів був достатнім для високоточної детекції фетальних анеуплоїдій. Ми також дослідили альтернативні набори, що містили менше TACS та/або TACS з різним вмістом GC. Ці експерименти дозволили нам дійти висновку, що найважливішим технічним фактором, що впливає на ефективність роботи методу, була кількість TACS на різних хромосомах, схожих за вмістом GC, а це давало можливість більш надійного коригування GC-зсуву. Ми помітили, що цей ефект був більше виражений на хромосомі 18: при застосуванні набору TACS, що не були оптимально співставленими за вмістом GC, 1 зразок Т18 був визначений як норма. Ці результати свідчать, що досліджуваний метод є чутливим до TACS із розбіжностями у вмісті GC, тому це дозволило нам створити оптимальний набір TACS на хромосомах 21, 18 та 13, що забезпечило правильну класифікацію як зразків норми, так і зразків трисомій (Рис.3).

Наша методика передбачає застосування надійного аналітичного алгоритму, який мінімізує випадкову та системну варіацію між постановками секвенування та є достатньо чутливим, щоб розрізнити еуплоїдні та анеуплоїдні зразки. Є чітка різниця між показниками ризику для трисомій та дисомій (Рис. 3), що дає можливість застосовувати схему двійкової (бінарної) класифікації.

Описаний у цій статті таргетний тест представляє собою інтегрований метод, який передбачає одночасне визначення фетальної фракції та точну детекцію фетальних анеуплоїдій. Цей алгоритм побудований на байєсівському підході до визначення фетальної фракції ДНК. До цієї моделі можна легко добудувати додаткову інформацію. Окрім цього, замість виведення точкової оцінки фетальної фракції ДНК, цей алгоритм обчислює апостеріорний розподіл фетальної фракції ДНК у кожному зразку. У подальшому він використовує нижню межу відповідного 95%-го довірчого інтервалу для того, щоб визначити, чи має той чи інший зразок достатню фетальну фракцію, чи ні. Такий консервативний підхід до визначення фетальної фракції забезпечує врахування найнижчої можливої фетальної фракції для цілей класифікації, таким чином мінімізується ймовірність неправильної класифікації, що може бути пов’язано з низькою часткою фетальної ДНК. Такий інноваційний алгоритм визначення фетальної фракції був також ретельно валідований незалежними спеціалістами із застосуванням локусів хромосоми Y у зразках від осіб чоловічої статі. Алгоритм розрахунку фетальної фракції був також протестований на зразках невагітних жінок. Цей алгоритм точно визначав відсутність фетальної ДНК у цих зразках.

У цьому дослідженні визначено 3 зразки з Т21 і 2 з Т18, в яких була низька фетальна фракція. Це ще раз доводить необхідність точної оцінки фетальної фракції при НІПТ для уникнення хибно-негативних результатів [32]. Описаний тут таргетний метод має внутрішньо притаманну йому велику глибину секвенування, що забезпечує високоточне кількісне визначення фетальної фракції та детекції анеуплоїдії. У клінічній практиці визначення низької фетальної фракції має надзвичайно велике значення, це потрібно для того, щоб повторно призначити взяття аналізу крові для повторного аналізу.

У поточному дослідженні оцінка зразків з багатьох центрів проводилась у вигляді простого поточного тестування, що можна легко відтворити в умовах реальної клінічної практики. Майбутня робота в основному зосереджуватиметься на зразках вагітних І триместру та з низьким ризиком, тому що НІПТ має тенденцію до переходу зі скринінгу в ІІ триместрі на скринінг в І триместрі та з високого та помірного ризику на низький. Наші дані свідчать про те, що цей метод демонструватиме однакову виняткову точність як для зразків низького, так і високого ризику.

Описаний тут таргетний неінвазивний пренатальний тест має декілька переваг у порівнянні з методами повногеномного секвенування. Для повногеномного секвенування потрібна дуже велика кількість зчитувань, крім того, одночасно можна аналізувати лише декілька зразків. Така обмежена продуктивність, властива методу повногеномного секвенування, пов’язана зі значними фінансовими та логістичними проблемами. А для описаного тут таргетного методу, навпаки, потрібні лише певні специфічні регіони геному, що суттєво зменшує кількість необхідних зчитувань. Це призводить до стрімкого підвищення ефективності та значного зменшення загальних витрат. Водночас, збагачення лише певних регіонів геному дає можливість корекції GC-зсуву та забезпечує високий рівень збагачення, що в результаті дає дуже високу точність детекції анеуплоїдій. Таргетна природа методу також забезпечує надзвичайно високу точність, пов’язану з надійним і точним визначенням фетальної фракції та відсутністю варіації числа копій генів або інших складних геномних архітектурних елементів, що можуть призводити до хибнопозитивних або хибнонегативних результатів [33, 34].

Хоча у порівнянні з традиційними методами скринінгу НІПТ має великі переваги, залишається низка невирішених питань. Було помічено, що при фето-плацентарному мозаїцизмі результати НІПТ і каріотипування плода можуть відрізнятися [35]. Хромосомний мозаїцизм у біоптатах хоріону виявляють у 1–2% випадків, при цьому можуть виявлятися різні числові або структурні хромосомні аномалії та фето-плацентарні лінії [36]. Істинний фетальний мозаїцизм (ІФМ) підтверджують лише у 13% випадків, водночас у 87% хромосомні аномалії стосуються лише плаценти (обмежений плацентарний мозаїцизм (ОПМ)) [37].

Відомо, що вфДНК у материнській плазмі крові з’являється у результаті апоптозу клітин зовнішнього прошарку плаценти, тобто клітин цитотрофобластів та синцитіотрофобластів [38].

Випадки з мозаїцизмом, у яких хромосомна будова цитотрофобласту відрізняється від будови цитотрофобласту плоду, є потенційними джерелами хибнопозитивних та хибнонегативних результатів. ОПМ типу I та III з патологічними цитотрофобластами та нормальними амніоцитами можуть давати хибнопозитивні результати, а от ІФМ типу V з нормальними цитотрофобластами та патологічними амніоцитами можуть давати хибнонегативні результати [36].

Найбільше моноцентрове дослідження, у якому вивчався зв’язок хромосомного мозаїцизму з результатами НІПТ, проводило ретроспективну перевірку 52673 зразків біоптату хоріону. Проводили цитогенетичний аналіз цитотрофобластів (прямий) та мезенхіми ворсин хоріону (культура), після чого випадки мозаїцизму, визначені за біопсією хоріону, підтверджували амніоцентезом [36]. За даними цього дослідження, сукупний показник хибнопозитивних результатів по Т21, Т18 та Т13 склав 1 на 3006 випадків, а хибнонегативних результатів – 1 на 107. Оскільки аномалії, пов’язані з Т13 та Т18, зазвичай виявляються на ультразвуковому дослідженні, і такі вагітності закінчуються самовільним абортом в період між 12 тижнями та терміном [39], основна проблема залишається з хибнопозитивними та хибнонегативними результатами Т21. Беручи до уваги частоту Т21 у загальному населенні (40) та частоту ІФМ типу V (36), кількість випадків Т21 з хибнонегативними результатами становить приблизно 1 на 100 000 НІПТ тестів. Окрім того, знаючи, що для того, щоб отримати хибнонегативний результат Т21 [36], потрібно принаймні 70% ОПМ, частота хибнонегативного результату Т21 має бути приблизно 1 на 13 000. Хоча ці значення дуже низькі, однак, розробляючи шляхи впровадження цього методу як елементу стратегії допологової допомоги, важливо розуміти генетичну фізіологію плаценти та обмеження, які це створює для НІПТ.

Дуже важливою задачею в сфері пренатального тестування є зменшення кількості непотрібних інвазивних маніпуляцій. Тестування вфДНК може достовірно зменшити кількість втрат, асоційованих з маніпуляціями, при цьому забезпечуючи високі показники детекції. Для лікарів та майбутніх батьків цей метод є потужним інструментом, який є безпечним для вагітних та допоможе їм у прийнятті поінформованих рішень стосовно потреби у проведенні інвазивних маніпуляцій. Цей клінічний аспект тестування вфДНК виявився дуже важливим, про що свідчить його швидка інтеграція в систему допологової допомоги. Масштаби потенційного застосування тестування вфДНК як інструменту універсального скринінгу на Т21, Т18 та Т13 залежать в основному від точності методу, низької кількості незадовільних результатів та вартості. У цьому дослідженні ми представили інформацію про розробку та валідацію інноваційного, економічно доцільного та винятково точного методу НІПТ на анеуплоїдії 21, 18 та 13 хромосом та визначення статі плоду.