На початку 2018 року китайські дослідники повідомили про успішне клонування приматів. Що таке клонування і чому це важливо?

Клонування (від грецької clonos – гілка) – вирощування біологічної (і генетичної!) копії. Термін запропонував британський біолог і філософ Джуліан Гакслі у 1960 році, причому саме в контексті розмноження людини. Коли ж про клонування кажуть у середовищі експериментальних біологів, то в першу чергу мова йде про отримання копій молекул ДНК і РНК. «Клонувати ген» для науковця – це отримати окрему копію гену у вигляді, доступному для аналізу. Кожен ген (чи інша генетична послідовність) знаходиться в геномі в оточенні тисяч інших подібних елементів, тому для дослідження треба виокремити його, вставити в спеціальну «касету», генетичний вектор або переносник, який дозволяє перенести цей ген до різних модельних клітинних систем, де можна вивчати роботу цього гену, його експресію. Сьогодні молекулярне клонування – цілий розділ експериментальної біології, який об’єднує біохімічні, клітиннобіологічні, фізико-хімічні, мікробіологічні методи. Втім, кого цікавить копіювання якихось там молекул – коли вже будемо копіювати людей?!

Живі організми значно складніші за молекули, з яких вони складаються. Тим не менше, людство навчилося отримувати копії організмів – тобто клонувати їх (!) значно раніше за розуміння хімічного складу живого та й за появу самого поняття «клонування». Коли фермер відрізає «вуса» садових суниць та встромляє їх у ґрунт, то отримує генетичну та біологічну копію батьківської рослини. Коли пивовари заражають пивне сусло тими ж дріжджами, що й минулого разу, вони отримують множинні копії дріжджових клітин. Все це є клонуванням.

А що ж із тваринами? Тварини переважно не розмножуються вегетативно. Звісно, відому всім зі школи гідру можна ділити навпіл, на чверті тощо та отримувати окремі організми. Та й дощового черв’яка лопатою легко «розмножити»: відносно великі фрагменти тварини регенерують до цілої. Проте все це не підходить до найцікавіших нам хребетних тварин. Якщо ми хочемо отримати біологічні та генетичні копії хребетних, то треба маніпулювати з генеративними або зародковими клітинами. Але як?

Постійні читачі нашої рубрики пам’ятають, як це починалося в науці. Німецький ембріолог і Нобелівський лауреат Ганс Шпеман, озброєний волосиною власної маленької доньки, навчився відділяти окремі бластомери зародків амфібій та довів, що перші клітини, на які поділилася зигота, володіють тотіпотенс­тістю – здатністю сформувати цілий організм. А його співробітниця Гільда Мангольд навчилася пересаджувати окремі бластомери від одного ембріона до іншого (Ті, хто пропустив, можуть почитати цю цікаву дослідницьку історію з гендерним аспектом і трагічним кінцем у №1 (85)/2018 нашого журналу).

Наступний крок теж був увінчаний Нобелівською премією. Англійський біолог Джон Гердон у 1950-х роках вирішив перевірити питання, яке займало біологів не менш як півсторіччя: чи ядра всіх клітин однакові?

На той час уже було відомо, що саме в ядрі знаходиться генетична інформація, тому проблема була важлива як для ембріологів, так і для генетиків. Гени складаються з ДНК, яка знаходиться в хромосомах. Хромосоми – паличкоподібні чи хрестоподібні структури – з’являються під час поділу клітини, а між поділами утворюють хроматин (від грецького слова «хромос» – колір, барвник). Саме ця частина клітини забарвлювалася лужними барвниками. Експеримент Гердона був простий за дизайном, проте вимагав дуже тонкої техніки. Потрібно було перенести ядро з соматичної клітини епітеліоциту кишечника дорослої жаби до заплідненої яйцеклітини, з якої попередньо мало бути вилучене власне ядро.

Для цієї роботи клітини кишечника було висаджено в культуральне середовище, де б клітини росли одним шаром, щоб було легко дістатися кожного ядра. З заплідненої яйцеклітини ядро було вилучено за допомогою освітлення ультра­­фіолетовими променями. Потім за допомогою найтонших скляних мікропіпеток, які з’явилися в арсеналі дослідників у другій половині 1940-х років (порівняйте з «волосяними ласо» Шпемана й Мангольд) ядро з культивованої клітини кишечника переносили до цитоплазми зиготи. Десятки експериментів, і, нарешті, 1958 року посміхнулася вдача: зародок зі привнесеним соматичним ядром розвинувся в повноцінний організм, маленького пуголовка жаби Xenopus!

Звісно, знайшлися й скептики. Подумаєш, сказали вони. Ще у 1952 році американські ембріологи Роберт Бріггз та Томас Кінг вже зробили те ж саме. Проте ядра вони брали з ембріональних клітин, з бластули зародка жаби. Але хто сказав, що клітини кишечника у культурі не перетворилися на ембріональні клітини? Довести свою правоту науково суворо Гердон не зміг. Лише 1975 року інша група швейцарських дослідників підтвердила: пуголовка, а за ним і жабу можна отримати з ядра з однозначно диференційованої соматичної клітини – B-лімфоцита на стадії плазмоцита, прямо під час секреції антитіл. Пріоритет і важливу роль Джона Гердона у розвитку клітинних технологій було встановлено та вшановано Нобелівською премією з фізіології та медицини 2012 року.

Але то жаби, істоти на наш людський погляд досить примітивні – водяні, холоднокровні, з зовнішнім заплідненням. Коли вже історія дійде до клонування «вінця природи», спитають нетерплячі читачі? Довелося почекати й у реальному житті – майже 40 років. 1997 року група дослідників із Шотландії оголосила про успішне народження роком раніше першого клонованого ссавця, знаменитої вівці Доллі. У запліднену яйцеклітину, зачату вівцями чорної породи, підсадили ядро з фібробластів дорослої вівці білої породи. Доллі якраз була білою, що, окрім генетичних тестів, наоч­но свідчило про факт клонування. Розроблена технологія відкрила шлях до клонування інших ссавців. На сьогодні клонувати вдалося близько 20 видів ссавців, переважно свійських та сільськогосподарських тварин, а також лабораторних модельних тварин. Корова, коза, собака, кішка, верблюд, миша, щур – усіх цих тварин клонували за 20 років, що пройшли від народження Доллі. Але серед цих тварин не було жодного примата. Звісно, у пресі час від часу з’являлися повідомлення про ніби-то народження клонованої дитини виду Homo sapiens, та жодного разу вони не підтвердилися публікаціями у провідних міжнародних рецензованих журналах. А без таких публікацій скептичні вчені мали повне право стверджувати: дієвої технології клонування людини досі не існує. Ба більше, донедавна не існувало такої технології й для будь-яких приматів, наших еволюційно найближчих родичів. Лише наприкінці 2017 року групі китайських учених вдалося виростити двох здорових макак-крабоїдів – перших приматів, отриманих шляхом переносу ядра соматичної клітини.

Проблеми з приматами неунікальні. Насправді кожен вид тварин має свої особливості будови яйцеклітини та її фізіо­логії, які вимагають адаптації технології. Наприклад, яйцеклітини свиней темні, ядро не видно на тлі цитоплазми, тому його важко знайти й видалити. Тільки додавання флуоресцентних барвників дозволило виявити розташування ядра. Інший складний для клонування вид – звичайний свійський собака. Яйцеклітина домашнього улюбленця дозріває у яйцеводах самиці, умови в яких важко відтворюються в лабораторії. Дослідження 2002—2007 року, що не змогли створити новий організм макаки резуса, тим не менш, виявили одну з причин невдач. Виявилось, що у яйцеклітині приматів наявні два важливі білки, відсутні у ядрі соматичних клітин. Ці білки відповідають за правильний розподіл хромосом у дочірніх клітинах під час поділу на стадії бластуляції. У ядрі соматичних клітин приматів таких клітин не виявлено.

Ядра ембріональних та диференційованих соматичних клітин практично ідентичні в сенсі послідовності ДНК. Але склад активних генів та синтезованих за їхньою програмою білків суттєво відрізняється. Це досягається у клітинах шляхом зміни стану хроматину – комплексу білків, перш за все гістонів, з ДНК. Гістони – це лужні, тобто позитивно заряджені білки. Вони збираються по чотири у маленькі діжечки, на які намотується подвійна спіраль дезоксирибонуклеї­нової кислоти (негативно заряджені кислоти). Чим щільніше негативно заряджена ДНК прилягає до позитивної діжечки, тим компактніший хроматин і тим менше зчитується послідовність гена. Крім центральної структури, гістони мають ще довгі білкові «хвости», деякі амінокислот залишки яких можуть бути хімічно-модифіковані за допомогою спеціальних клітинних ферментів. На гістони від хвости навішуються залишки метилу, ацетилу, фосфату і навіть прикріплюються цілі невеличкі білки, убіквітини та убіквітин-подібні (SUMO). Якщо приєднана група нейтралізує позитивний заряд гістонів, то ДНК звільняється від потужних обійм, а ген, що знаходиться на модифікованій ділянці, починає працювати, зчитуватися, експресувати. Якщо ж взаємодія ДНК з гістоном посилилася, то ген «вимикається», «замовкає».

Стан гістонів та хроматину активно змінюється під час ембріогенезу та диференціації клітин. Вмикання та вимикання синтезу різних білків якраз і регулюється модифікаціями гістонів. Ядро більш диференційованої клітини для виконання ембріональних функцій вимагає хімічних змін у хвостах певних гістонів. Схоже на те, що трансплантоване до яйцеклітини жаби ядро диференційованої клітини спонтанно змінює свій хроматин у ембріональний стан.

А ось ядра ссавців, імовірно, мають таку складну регуляцію, що самостійно повернутися на початкову стадію розвит­ку вже не можуть. Їм cлід допомогти. Але ферментів модифікації хроматину сотні – на які потрібно діяти? Це вивчається методом спроб і помилок. У 2006 році додаванням трихостатіну А, блокатора гістодеацетилази (ферменту, який відрізає від гістонового хвоста ацетильну групу) до культивованих яйцеклітин миші з заміненим ядром вдалося суттєво підвищити частоту вдалого клонування цих тварин.

Щоб досягти успіху з мавпами, китайські дослідники теж використали трихостатін А. Крім того, вони виявили, що бар’єром для перепрограмування хроматину трансплантованого є метилювання 9-го амінокислотного залишку хвоста гістону H3,а саме лізину. Для подолання цього бар’єру біологи ввели до трансплантованих клітин матричну РНК, що відповідає за синтез ферменту деметилази 9-го лізину. Саме цьому, вочевидь, завдячують своїм народженням мавпочки Жанг-Жанг та Хуа-Хуа. З близько 400 яйцеклітин, в яких були замінені ядра, із 60 вагітних самиць народилися лише двоє здорових нащадків [Zhen et al., Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer. Cell, 2018. DOI:10.1016/j.cell.2018.01.020]. Критики також відмічають, що успішний експеримент проведено лише з фетальними, а не дорослими фібробластами, що свідчить про можливі проблеми технології, ще неусвідомлені дослідниками. Ясно також, що низька ефективність та висока вартість технології поки що зводить нанівець мрії чи перестороги деяких людей щодо армій клонів, готових захоплювати землі й ресурси. Навіть якщо йдеться про клонів макак. Людина ж являє собою новий об’єкт, з ще більш складними ядерними процесами. Достатньо згадати лише максимальне число ферментів редагування ДНК серед ссавців, задіяних у регулюванні велетенського числа унікально консервативних мобільних послідовностей транспозонів.

Лідер китайської групи Мумінг Пу каже, що клонування людини не є метою цих досліджень. Він також відкидає звинувачення у негуманності до мавп. Генетичні копії макак можуть прислужитися для створення моделей невиліковних хвороб мозку (Альцгеймера, Паркінсона, Гантінгтона тощо), які неможливо адекватно вивчати на гризунах. А значить, технологію будуть поліпшувати. Щодо людини, то великого резону клонувати людей поки не видно. Тому етичні сумніви й надалі будуть домінувати.