Л. В. Тавокина, к. биол. н., зав. молекулярно-цитогенетической лабораторией Медицинского Центра ТОВ «Исида-IVF», врач-лаборант генетик высшей категории, г. Киев
В настоящее время не вызывает сомнений тот постулат, что ни одна врачебная специальность не может обойтись без знаний основ медицинской генетики, так как наследственные болезни могут поражать все органы и системы органов человека. И первыми сталкиваются с имеющимися у плода, а затем у новорожденного генетическими проблемами, естественно, врачи акушеры-гинекологи, неонатологи, педиатры и врачи семейной медицины.
Наследственные болезни – это заболевания, возникновение и развитие которых связано с изменениями (мутациями) генетического материала клетки. От наследственных следует отличать врожденные заболевания, которые обусловлены внутриутробными повреждениями, вызванными, например, инфекцией или воздействием других факторов на плод во время беременности.
Ключевым моментом медицинской генетики является совершенствование и разработка новых более точных методов, которые позволяют проводить дифференциальную диагностику с целью лечения и профилактики наследственных болезней человека.
Таким образом, генетическое тестирование дает ответ на два главных вопроса:
- Врожденная или наследственная природа выявляемых пороков развития?
- На каком уровне произошла поломка/нарушение?
В настоящем генетическая диагностика возможна на нескольких уровнях:
а) генном (обнаружение мутаций в молекуле ДНК);
б) хромосомном (обнаружение нарушения в структуре упакованной с помощью белков компактной молекулы ДНК, т. е. хромосоме);
в) геномном (геном – совокупность всего наследственного материала, заключенного в клетке организма);
г) эпигеномном (обнаружение нарушений во взаимодействии между геномом и продуктами его работы. т. е. нарушений в регуляции работы генов).
В данной работе мы остановимся только на цитогенетической диагностике или диагностике на уровне хромосом. «Хромосома» в буквальном переводе означает «окрашенное тело», поскольку оснóвные красители хорошо связываются хромосомами. Хромосомы – это структуры в ядре клетки, состоящие из ДНК и белка, которые сохраняют, реализуют и передают наследственную информацию следующему поколению. Хромосомы доступны для исследования в световом микроскопе только во время деления клетки. Кариотип – совокупность признаков (число, морфология и др.) полного набора хромосом, присущая клеткам данного организма или линии клеток (клон).
Кариотипирование – традиционный цитогенетический метод, который позволяет выявлять отклонения в структуре и количестве хромосом. GTG-бэндинг – основная техника дифференциального окрашивания хромосом по длине. Метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) – метод молекулярной цитогенетики, с помощью которого выявляются незначительные перестройки в хромосомах, которые не обнаруживаются традиционными цитогенетическими методом. Другими словами, это метод, дополняющий кариотипирование.
В норме кариотип человека состоит из 46 хромосом – 22 пары аутосом и две половые хромосомы: женский кариотип – 46,ХХ, мужской кариотип – 46,ХY.
Для клинической цитогенетики имеет значение:
а) постнатальное кариотипирование – определение кариотипа в лимфоцитах периферической крови;
б) пренатальное кариотипирование – исследование хромосом плода, которое проводится по клеткам околоплодных оболочек (хорион/плацента), околоплодным водам и в более поздние сроки – по пуповинной крови плода.
Хромосомные синдромы – это заболевания, обусловленные изменениями в количестве (анеуплоидии) или в структуре отдельных хромосом в кариотипе пациента. Эти поломки возникают в результате мутаций в половых клетках родителей или могут передаваться от родителей-носителей сбалансированных хромосомных перестроек детям. Частота хромосомных аномалий среди новорожденных составляет 5–7 на 1000 [1], в группе пациентов с репродуктивными проблемами — 5–7% [2], а в группах детей с задержкой умственного развития она гораздо выше — 8–20% по данным разных авторов.
В основном, хромосомные синдромы характеризуются наличием у пациента:
а) различных нервно-психических расстройств;
б) множественных врожденных пороков развития (МВВР) систем и органов, нарушения полового развития;
в) различных стигм дисэмбриогенеза (незначительные анатомические отклонения);
г) отставания в росте и развитии (пренатального или постнатального).
Хромосомные синдромы – очень тяжелые заболевания, которые, как правило, не поддаются терапевтической коррекции. А пациенты с такими заболеваниями являются инвалидами. Поэтому очень важно, чтобы диагностика этих болезней проводилась своевременно, а генетическое тестирование соответствовало мировым стандартам.
Основной принцип цитогенетической диагностики состоит в выяснении:
а) характера обнаруженных в кариотипе пациента изменения хромосом – сбалансированный или несбалансированный;
б) происхождения хромосомной перестройки в кариотипе пробанда – родительское (один из родителей является носителем) или она возникла впервые (de novo).
От ответа на эти два главных вопроса зависит прогноз для пробанда и профилактика рождения в данной семье потомства с хромосомной патологией.
Нарушения в хромосомах происходят при гаметообразовании в период редукционного деления, когда во время конъюгации может возникнуть нерасхождение хромосом, ведущее к увеличению/уменьшению их числа или к структурным перестройкам. Возможно также нарушении в одной из клеток в период дроблений зиготы или на более поздних стадиях развития. В таких случаях только часть клеток содержит аномальный кариотип – хромосомный мозаицизм. При этом клиническая картина может быть менее выраженной. Все возможные варианты изменений описаны в международной номенклатуре хромосом (ISCN), которая является унифицированным руководством для цитогенетиков всего мира.
Возникшие спонтанно под воздействием различных факторов числовые изменения в кариотипе зародыша приводят к уменьшению (моносомия) или увеличению (трисомия) числа копий той или иной хромосомы. Теоретически это может произойти с любой хромосомой, но продолжительность жизни зародышей с аномалиями разных хромосом неодинакова. Из наиболее часто встречающихся хромосомных болезней у новорожденных диагностируются болезнь Дауна (три копии 21 хромосомы), синдромы Патау (три копии хромосомы 13), Эдвардса (три копии хромосомы 18), Тернера (только одна копия половой хромосомы Х), синдром Клайнфельтера (две копии хромосомы Х вместо одной в мужском кариотипе). При подозрении на хромосомную природу заболевания рекомендована консультация врача-генетика, который назначает пациенту традиционное кариотипирование. Оно проводится по лимфоцитам крови и сделать это можно еще в роддоме, т. к. при некоторых синдромах продолжительность жизни составляет дни/часы.
Наиболее простым, доступным в клинической цитогенетике, является анализ хромосом по лимфоцитам периферической крови. Достаточно 2 мл цельной венозной гепаринизированной крови, взятой стерильно. Наилучший способ взятия образца – с помощью моновета (Sarstedt Monovette, Li-Heparin LH/2.7ml), поскольку он позволяет максимально избежать инфицирования, что является одним из условий дальнейшего успешного культивирования клеток. Моновет со взятой кровью тщательно перемешивается и маркируется (Ф. И. О., дата рождения, дата и время забора). Такой образец сохраняется и доставляется в лабораторию при 4–8°С в течение суток. Нарушение температурного режима категорически запрещено.
Анализ проводится не натощак. Но за 1–2 дня из рациона питания пациента необходимо исключить жирную, жареную пищу, алкоголь, за 2 недели – прием антибиотиков, химиотерапевтических, гормональных препаратов и др. Забор крови у больных на ОВРЗ проводится не раньше, чем через 14 дней после выздоровления. Все эти меры предосторожности необходимы для того, чтобы избежать низкого митотического индекса культуры лимфоцитов, а, значит, и повторного взятия крови. Митотический индекс (MI, %) – процент делящихся клеток от общего числа проанализированных. И все же в небольшом проценте случаев существует риск низкого индивидуального МІ и пациенту назначают повторный забор крови.
Непригодной для анализа является гемолизированная или хилезная кровь, а также кровь со сгустками. Особенно «сложной» для кариотипирования является кровь новорожденных. По объяснимым причинам она чаще бывает с вышеперечисленными дефектами, в недостаточном количестве, и требует повторного взятия образца. Провести хромосомный анализ тяжелым детям, которые вынужденно должны находиться на поддерживающей инфузионной терапии, практически невозможно. Им назначается повторное кариотипирование, которое проводится после выписки из роддома спустя какое-то время. Поскольку набор хромосом во всех клетках индивидуума теоретически одинаков и не меняется в течение жизни, можно говорить о «хромосомном паспорте», а также рекомендовать пациенту хранить полученное изображение хромосом с цитогенетическим заключением и без необходимости не прибегать к повторному исследованию.
Нормальный кариотип, полученный в результате GTG-бэндинга и компьютерного анализа, не требует дополнительного исследования. Это так называемый первый уровень цитогенетической диагностики. Но если в кариотипе найдены отклонения, которые требуют более детального исследования, или имеет место несоответствие клинической картины и кариотипа, врач цитогенетик рекомендует исследование второго уровня. Второй уровень – это уточняющее дополнительное исследование с более высокой разрешающей способностью (можно идентифицировать фрагмент хромосомы менее 7–10 млн. пар н. о. ДНК). На этом уровне проводится диагностика методами FISH, который позволяет исследовать незначительные перестройки хромосом, не выявляемые простым кариотипированием. Поскольку стоимость FISH-исследования выше, чем при обычном кариотипировании, и число техник с каждым годом растет, желательно в каждом конкретном случае обсуждать с врачом цитогенетиком протокол уточняющего теста.
Продолжение в следующем номере. 
коментарів