Молекулярные маркеры диагностики ВПЧ-инфекции

Идентификация ВПЧ высокого инфекционного риска, этиологической причины развития рака шейки матки, дает возможность улучшить эффективность программ скрининга цервикального рака и ранней диагностики поражений, предшествующих раку

 Выявление ДНК вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР)  –  диагностический тест, характеризующийся более высокой чувствительностью по сравнению с цитологией. Однако, учитывая, что только у небольшого процента инфицированных женщин развивается инвазивный цервикальный рак, ВПЧ-тест имеет низкое положительное прогностическое значение (PPV) для внутриэпителиальных цервикальных неоплазий (CIN) высокой степени, карцином.

Исследования последних лет позволили обнаружить другие молекулярные маркеры, которые могут улучшить отбор ВПЧ-положительных женщин. Они преследуют три основные цели:

 1) идентифицировать женщин с наличием поражений CIN2+;

2) идентифицировать транзиторные инфекции;

3)     идентифицировать женщин, не имеющих поражений CIN2+ в настоящее время, но с высоким риском развития предраковых поражений в течение следующих трех лет.

Предложен ряд стратегий (табл. 1) для рутинной лабораторной практики.

Иммунохимическое окрашивание белка p16INK4A

Экспрессия вирусных генов на начальном этапе инфицирования ВПЧ тесно связана с этапом дифференциации плоских эпителиальных клеток человека — экспрессия и репликация вирусных генов осуществляется только в окончательно дифференцированных клетках средних и верхних клеточных слоев. Эта фаза может быть названа «репликативная инфекция». Однако, если в базальных клетках теряется контроль над вирусными генами, вирусные онкогены E6 и E7 интенсивно экспрессируются в базальных и парабазальных слоях эпителия. Это ведет к хромосомной нестабильности и может провоцировать трансформацию пораженных клеток. Эта более поздняя фаза может быть названа «трансформирующая инфекция». Переход репликативной инфекции в трансформирующую сопровождается массовой сверхэкспрессией циклин-зависимых киназ p16INK4a (рис. 1).

С помощью окрашивания p16INK4a стала возможной визуализация клеток (рис. 2), которые приобрели трансформирующую модель генной вирусной экспрессии — то есть клетки с потенциальным риском неопластического прогресса, по сравнению с инфицированными ВПЧ клетками, которые еще сохраняют свою воспроизводимую модель генной экспрессии. Использование p16INK4a в качестве биомаркера в цитологии ведет к значительному сокращению числа неоднозначных цитологических результатов и может быть использовано в качестве инструмента для триажа женщин с неточной или сомнительной цитологией, особенно когда триажа с использованием ВПЧ-теста недостаточно.

На территории Украины данный вид исследований не выполняется. Однако в последнее время широкое распространение получил метод жидкостной цитологии, где, в отличие от классического цитологического мазка, клинический материал помещается в транспортную среду. Жидкостная цитология дает возможность выполнять иммуноцитохимические исследования. В лаборатории «Синэво» данная услуга введена с 2012 года, а в 2014 году планируется введение определения маркеров пролиферации р16 и ki 67.

Определение уровня экспрессии транскриптов генов Е6/Е7 ВПЧ

В результате жизнедеятельности вируса происходит выработка белков-онкогенов Е6/Е7, которые, воздействуя на разные мишени, приводят к сбою нормального жизненного цикла клетки, нарушению апоптоза и, как следствие, малигнизации. Существуют предположения, что присутствие белков-онкогенов характеризует наличие дисплазии, и, следовательно, наличие некоего количества мРНК Е6/Е7 может являться диагностическим маркером. Так, в работе K. Sotlar, H. C. Selinka, M. Menton, R. Kandolf, B. Bultmann (Inst for Pathology, Univ. of Tubingen, Tubingen, Germany) метод позволял обнаружить транскрипты вирусных генов даже в образцах эпителия без признаков дисплазии и в ЦИН 1. При наличии значимой вирусной нагрузки фоновая экспрессия мРНК Е6/Е7 также будет присутствовать, однако нет консолидированных данных, какой уровень мРНК следует считать пороговым для диагностических целей при прогнозировании дисплазии.  Определение транскриптов Е6/Е7 может стать полезным диагностическим инструментом эпидемиологических исследований, позволяющим оценить риск возникновения ЦИН и прогрессии заболевания с развитием цервикального рака, что имеет особое значение для ВПЧ-инфицированных пациенток с ЦИН 0 и ЦИН 1.

В Европе получил распространение тест Pretect HPV Proofer (NorChip), основанный на NASBA Real-Time, позволяющий выявлять РНК онкогенов 5 генотипов ВПЧ: 16, 18, 31, 33, 45. Однако определяемых генотипов недостаточно для обеспечения высокой диагностической чувствительности в регионах, где широко распространены генотипы 39, 52, 58 (рис. 3).

Таким образом, маркеры трансформирующей активации ВПЧ, такие как белок p16INK4a и мРНК Е6/Е7, являются интересным предметом для исследования, но их дальнейшее клиническое значение и применение требует изучения.

Метод гибридного захвата (HybridCapture^®2)

Метод гибридного захвата (HybridCapture^® 2 (HC2) Qiagen Gaithersburg Inc., США, ранее Digene Corp.) был первым ДНК ВПЧ-тестом, признанным в качестве золотого стандарта диагностики папилломавирусной инфекции. Это единственный тест выявления ВПЧ высокого онкогенного риска, одобренный FDA (Федеральное управление США по контролю за пищевыми продуктами и лекарствами).

В ряде крупномасштабных исследований по скринингу рака шейки матки (РШМ) была показана эффективность данного метода по сравнению с классической и жидкостной цитологией. В связи с этим тест HybridCapture^® 2 часто рассматривают и как эталонный метод для сравнения новых ВПЧ-тестов, направленных на скрининг предрака и РШМ. В основе теста лежит методика гибридизации ДНК ВПЧ со специфическими РНК-пробами в растворе с последующей хемилюминесцентной визуализацией ДНК-РНК гибридов с помощью моноклональных антител (рис. 4).

Тест не позволяет идентифицировать отдельные типы, дифференцируются только две группы типов ВПЧ: низкого онкогенного риска (6, 11, 42, 43, 44) и высокого онкогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68).

Отличительной особенностью теста является наличие выверенного по концентрации положительного контрольного образца, который используется в качестве порога отсечения положительных образцов с клинически незначимой концентрацией вируса папилломы человека. Таким образом, не являясь количественным, тест HybridCapture^® 2 выявляет только образцы с концентрацией ВПЧ выше заданного порога. Подобный дизайн позволяет игнорировать невысокие концентрации вируса, которые часто не имеют клинической значимости.

В настоящее время этот тест разрешен для применения в России, однако высокая стоимость теста ограничивает возможности его использования в программах скрининга. В Украине наиболее популярным методом для диагностики ВПЧ-инфекции и РШМ является ПЦР.

Преимуществами количественной ПЦР в реальном времени являются:

• Истинная количественность — кроме аналогичной HybridCapture^®2 сортировки образцов на лежащие выше или ниже порога, возможна оценка истинной концентрации вируса, что позволяет наблюдать пациентов в динамике, а также возможно введение порога повышенной концентрации ВПЧ, коррелирующей при персистентной форме инфекции с повышенным риском прогрессии диспластических изменений шейки матки.
• Возможность выявлять подпороговые (малозначимые при скрининге) концентрации вируса, что важно в постлечебном мониторинге.
• Возможность использовать внутренний контроль, отражающий адекватность взятия материала, пробоподготовки и амплификации. Тест HybridCapture^® 2, используя принцип люминесценции и, соответственно, один канал детекции на образец, полностью лишен внутреннего контроля. Это предопределяет возможность ложноотрицательных результатов.
• Возможность учитывать качество взятия материала при формировании результата. Использование в качестве внутреннего контроля ДНК человека и количественного расчета ее концентрации позволяет оценивать адекватность взятия материала и проводить нормализацию результата выявления ВПЧ на количество ДНК человека.

Определение ДНК ВПЧ ВКР с помощью ПЦР в реальном времени

После более чем 20 лет активных исследований по вопросам скрининга ВПЧ, основной вывод относительно ценности ВПЧ-теста следующий: ВПЧ-тест должен использоваться в качестве первичного инструмента цервикального скрининга. С помощью ВПЧ-теста можно обнаружить на 50–60% больше имеющих место клинически релевантных, не регрессирующих внутриэпителиальных цервикальных неоплазий 3 степени (CIN3), чем с использованием цитологии. Кроме того, в отличие от обычной цитологии, ВПЧ-тесты являются высоковоспроизводимыми и объективными, а их результаты имеют лишь небольшие различия между лабораториями.

Ряд международных организаций рекомендует ВПЧ-тест в качестве первичного инструмента цервикального скрининга

 Среди критериев, применяемых для принятия того или иного теста в качестве первичного скрининга, значится, что ВПЧ-тесты должны быть клинически утвержденными для гарантии того, что факт получения положительного результата указывает на высокую вероятность наличия поражения CIN высокой степени. Очень важно в этом контексте, чтобы тест обнаруживал только ВПЧ высокого канцерогенного риска, то есть те генотипы вируса папилломы человека, которые могут привести к развитию CIN высокой степени, а также чтобы их можно было отличить от транзиторных инфекций. Поэтому должен соблюдаться идеальный баланс между клинической чувствительностью и специфичностью для обнаружения CIN высокой степени.

В качестве инструмента скрининга должны использоваться ВПЧ-тесты, основанные на обнаружении широкого спектра высокоонкогенных генотипов ВПЧ. Современные тесты обнаруживают 10–12 типов ВПЧ ВКР и делятся на общие, то есть определяющие «коктейль» генотипов ВПЧ, и рекомендуемые для скрининговых программ, а также тесты, позволяющие проводить типирование ВПЧ. Типо-специфичные ВПЧ-тесты также могут быть использованы в рамках первичного скрининга, однако для этого необходимо подготовить платформы для проведения тестов, подходящие для массового скрининга большого объема. Поэтому тест, основанный на использовании «коктейля», будет самым подходящим для первичного скрининга. Типирование ВПЧ может использоваться для наблюдения за женщинами в индивидуальном порядке для оценки типо-специфической персистенции ВПЧ и в качестве теста для триажа (медицинской сортировки), комбинированного с цитологией для ВПЧ-положительных женщин. ВПЧ-тест дает возможность обнаружить на 50–60% больше поражений CIN высокой степени. Цитология является более подходящим тестом для триажа для компенсации немного низкой специфичности ВПЧ-теста для диагностики CIN высокой степени. Дополнительное генотипирование ВПЧ у женщин с положительным результатом ВПЧ-теста и отрицательной цитологией увеличивает специфичность.

В связи с вышесказанным, преимущества скрининга с использованием ВПЧ-теста для женщин и системы здравоохранения очевидны. ВПЧ-тест увеличит эффективность обнаружения клинически релевантных поражений CIN высокой степени, позволит снизить количество ложноотрицательных тестов (прогностичность отрицательного результата выше, чем у цитологии). Кроме того, учитывая, что риск CIN2+ у ВПЧ-отрицательных женщин в течение 3 или 5 лет после получения отрицательных результатов ВПЧ-теста намного ниже прогнозируемого риска по нормальным результатам цитологии, периодичность скрининга может быть смело увеличена до 6 или 7 лет. Что касается соотношения стоимость/эффективность, затраты на каждый индивидуальный скрининг будут немного выше, но это увеличение стоимости легко компенсируется за счет увеличения периодичности скрининга. Введение профилактической вакцинации против ВПЧ для молодых женщин, которые не подвергались ранее контакту с ВПЧ-инфекцией, также потребует адаптации программы скрининга к методам, основанным на обнаружении ВПЧ.

Следует помнить, что анализ на ВПЧ не рекомендуют проводить пациенткам моложе 30 лет из-за высокого преобладания инфекции ВПЧ в этой возрастной группе и частых процессов естественного клиренса вируса. Считается, что 80% инфекций ВПЧ, включая инфекции, вызванные типами высокого онкогенного риска, никогда не превращаются в дисплазию, и у большинства пациенток с положительным результатом на ВПЧ вирус не обнаруживают по прошествии 6–12 месяцев.

  ВПЧ-тест увеличит эффективность обнаружения клинически релевантных поражений CIN высокой степени, позволит снизить количество ложноотрицательных тестов (прогностичность отрицательного результата выше, чем у цитологии)

 В 2007 году были опубликованы интересные данные о распространенности ВПЧ в разных возрастных группах по регионам мира (рис. 5). Помимо изменчивости показателей на графике видно преобладание ВПЧ среди молодых женщин, снижение в группах среднего возраста и повторное увеличение в пред- и постменопаузный период. Интерпретация повторного увеличения частоты обнаружения ДНК ВПЧ стала предметом дебатов. Были предложены три объяснения данного факта:

1. Результат повторяющихся новых инфекций в группах среднего возраста.

Тот факт, что низший предел и точку перегиба на графиках отделяет 10 лет у населения Европы и Северной Америки (красные стрелочки), скорее говорит об изменении поведения (смена партнеров и новые сексуальные партнеры), а не о биологическом эффекте, связанном с возрастом.

2. Реактивация латентных инфекций в предменопаузный период в связи со снижением иммунитета и гормональным фоном.

Лучшими примерами латентного состояния (очень низкое число копий в базальном слое, которые можно обнаружить только в биопсийном материале и с использованием высокочувствительных методов) являются акцепторы трансплантатов, у которых увеличивается частота обнаружения ВПЧ после иммуносупрессорной терапии. Тем не менее нет прямых доказательств, поддерживающих данную гипотезу.

3. Долгосрочное воздействие эффектов когорты, когда большее количество женщин старшего возраста были подвержены контакту с ВПЧ (и сохранению инфекции), чем количество женщин современного поколения.

Лаборатория «Синэво» предлагает 5 тестов  для определения ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска. Все тесты выполняются в формате Real-time ПЦР с использованием наборов реагентов «АмплиСенс» (производство ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия), которые соответствуют международным требованиям к тестам для определения группы риска предраковой и раковой патологии и могут быть рассмотрены как первичные тесты в скрининге РШМ. Это качественный тест (код услуги 3021, ПЦР. ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59, 67 (соскоб, скрининг, качественное определение, с определением 16 генотипа); два теста на определение вирусной нагрузки ВПЧ (код услуги 3032, ПЦР. ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,58, 59 (соскоб, количественное определение, без генотипирования, Real-time) и код услуги 3035, ПЦР. ВПЧ 16, 18 (соскоб, количественное определение, Real-time); генотипирование ВПЧ (код услуги 3033, ПЦР. ВПЧ 16, 18, 31, 33, 3, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 (соскоб, качественное определение, генотипирование, Real-time), и ПЦР. ВПЧ Квант-4 (6, 11, 16, 18 генотипы).

 Резюмируя, первичным инструментом цервикального скрининга рекомендован ВПЧ-тест, в основе которого лежит обнаружение ДНК высокоонкогенных генотипов ВПЧ в количественном формате.