Стволовые клетки и биоинженерия

Пока у больного есть дыхание, говорят, есть и надежда.

Цицерон

Помню первые мобильные телефоны – огромные, тяжелые и уродливые трубки… Сегодня мы выбираем смартфоны по вкусу и цвету… Нечто подобное происходит сейчас и в тканевой биоинженерии. Первый шаг в этом направлении тоже напоминает прародителя сотовых телефонов – мышка, под кожей спины которой растет человеческая ушная раковина. Тогда лабораторное животное было использовано как естественный «биореактор», который давал возможность стволовым клеткам приживаться и дифференцироваться на искусственном биополимерном каркасе (рис. 1)…

Сегодня уже начаты эксперименты по изготовлению органов с помощью технологии 3D-печати – удалось создать почку, сердце и даже глаз. В хирургии и травматологии разрабатываются методики печати протезов на 3D-принтере, создающем сверхточную модель бедра, колена, локтя. «Чернилами» для такой печати служат стволовые клетки. Недалеко то время, когда у нас появится возможность ремонтировать себя бесконечное количество раз (рис. 2)…

Конечно, пока такие разработки находятся на стадии эксперимента, но труд десятков тысяч ученых всего мира не может не дать позитивных результатов, причем уже в обозримом будущем. Тема тканевой инженерии огромна, поэтому мы поговорим лишь о реперных точках, определяющих развитие регенеративной медицины на новом уровне.

Начнем с репродукции человека. Нет, это не репродуктивное клонирование, а разработка новых технологий, позволяющих бесплодному мужчине стать биологическим отцом, а женщине – матерью.

Сперма

Карим Найерния из университета Ньюкасла разработал технологию создания полноценных сперматозоидов из стволовых клеток кожи и костного мозга. В 2006 году в его лаборатории с помощью этого метода родились первые мышата.

Яичники

Группа Терезы Вудрафф в Институте исследования женского здоровья создала на 3D-принтере «биопротезный яичник»: специалисты разработали специальный каркас из гидрогеля, в котором были сделаны небольшие отверстия для размещения фолликулов, а также структуры, стимулирующие рост кровеносных сосудов. Затем такие яичники были засеяны фолликулами и трансплантированы самкам мышей, собственные яичники которых были удалены. После спаривания эти подопытные мыши принесли полноценное потомство.

Кровь

Не меньшее внимание уделяется и проблемам крови. В 2012 году специалисты из Гарвардского университета (Бостон, США) разработали способ превращения стволовых клеток в заготовки клеток крови. По словам руководителя исследовательской группы Райохиши Сугимура, эта технология поможет тем, кто нуждается в срочном переливании крови редких групп.

Кожа

Французским ученым на основе технологий тканевой биоинженерии удалось вырастить из стволовых клеток человеческую кожу, необходимую при лечении пострадавших от ожогов. Группу ученых возглавляет Марк Песшански, директор французского Института исследования стволовых клеток. Коллектив под его руководством разработал технологию на основе первоначального получения из стволовых клеток кератиноцитов. Затем на их основе выращивается полноценная кожа, имеющая роговой слой. Как показали проведенные опыты, такая искусственно выращенная кожа человека полностью соответствует по своим характеристикам его естественной коже. На завершающей части исследования, проведенного совместно с испанскими учеными, была отработана методика пересадки искусственной кожи.

Мышцы

Группа профессора Брэдли Олвина трансплантировала стволовые клетки-предшественницы мышечной ткани мышке-реципиенту, у которой были повреждены мышцы конечностей. Результаты исследования показали, что мышечные стволовые клетки не только восстанавливают поврежденную мышцу, но и удваивают ее массу. Результаты сохраняются в течение всей жизни мыши-реципиента. «Мы ожидали, что стволовые клетки после трансплантации увеличат свою популяцию, восстановят поврежденную мышечную ткань, а затем погибнут. Но наши предположения не оправдались» – комментирует эксперимент профессор Олвин. – «Введенные стволовые клетки постоянно делились, снижая скорость старения мышцы после трансплантации, а также сохраняли мышечную силу и массу. До оценки результатов эксперимента мы считали, что увеличенная мышечная масса поврежденной конечности мыши-реципиента вернется к первоначальным значениям в течение нескольких месяцев. Вместо этого мышечная масса поврежденной конечности увеличилась на 50%, а ее объем возрос на 170%. Эти изменения сохранились до конца жизни мыши-реципиента, продолжавшейся около двух лет».

Кости

Компания Epi Bone разработала новую технологию трансплантации костей – их выращивают из стволовых клеток самого пациента. Cначала проводят компьютерную томографию поврежденного участка для вычисления и конструирования персонализированного трехмерного каркаса, а затем берут у больного образец жировой ткани, откуда извлекают стволовые клетки и внедряют их в уже сделанный каркас. После чего матрица, заселенная клетками, помещается в биореактор.

Через три недели формируется живая человеческая кость, имеющая размеры и форму, необходимые для пациента.

Тимус

Исследователи из университета Эдинбурга непосредственно в организме подопытной мыши вырастили тимус. Это центральный орган иммунной системы, расположенный за грудиной, в котором созревают T-клетки иммунной системы. У эмбриона мыши были взяты фибробласты – клетки соединительной ткани. С помощью генной инженерии они были перепрограммированы в клетки тимуса и вместе с другими ключевыми клетками этого органа пересажены мыши. Из этих клеток вырос полностью идентичный настоящему и функционирующий тимус.

Создание перечисленных выше тканей особых трудностей не вызывает, и часть из этих технологий перешагнула этап эксперимента и применяется в клинике уже сегодня. Гораздо сложнее создать орган, полностью воспроизведя при этом все его клеточное многообразие, а самое главное – его функции. В этом направлении разрабатывается несколько биотехнологических подходов.

Для начала вернемся к мышке с человеческим «ухом». Соавтор этой технологии Линда Гриффит — профессор биоинженерии и механической инженерии Масачуссетского технологического института (в 2006 году получила стипендию Мак-Артура – «грант для гениев») – сегодня развивает технологии культивации 3D-культур клеток печени в биореакторе, а также участвует в проекте «Человек на чипе».

Еще один соавтор «ушной технологии» Чарльз Ваканти — профессор медицинской школы Гарварда – вырастил первую искусственную кость нужной анатомической формы для пациента с травмой большого пальца.

Технологии, разработанные Линдой Гриффит и Чарльзом Ваканти, сейчас применяются для создания искусственных органов со сложной структурой. Сначала формируется каркас из биодеградирующего полимера, который затем заселяется клетками. После распада каркаса остаются только клетки, сохраняющие его форму. Это своего рода попытка симулировать работу гомеобокс-генов, отвечающих за формообразование органов в период внутриутробного развития.

Второй подход заключается в использовании вместо биополимера соединительнотканного матрикса органа. Клетки донорского органа уничтожаются, а полученный матрикс заселяют клетками реципиента. Заселение каркаса должно происходить в условиях, максимально приближенных к условиям внутри организма – с оптимальной температурой и снабжением питательными веществами всех его частей.

Такие технологии успешно разрабатываются в Краснодарском Международном научно-исследовательском клинико-образовательном центре регенеративной медицины под руководством профессора Елены Губаревой. Центр проводит исследования, направленные на изучение регенерации внутригрудных органов и тканей. Ученые уже успешно пересаживают лабораторным животным органы планарной (плоской) пространственной организации, типа диафрагмы, созданные в биореакторе.

Кроме того, получены бесклеточные каркасы сердца и легких, причем, без разрушения внеклеточного матрикса. Процесс децеллюляризации происходит в биореакторе под воздействием ферментов и растворов детергентов различной концентрации. Они разрушают клеточную мембрану, и остаются только компоненты внеклеточного матрикса. В итоге орган при сохранении трехмерной формы, становится полностью бесклеточным и состоит из коллагенов, эластина, фибронектина и других компонентов внеклеточного матрикса, который затем заселяется клетками реципиента (рис. 3).

Испанские ученые представили новый метод создания искусственных органов для трансплантации с использованием матриц от органов животного происхождения, то есть ксенотрансплантации, который позволит значительно снизить риск отторжения пересаженного органа. Метод заключается в очистке от клеток животного пересаживаемых органов с последующей заселением оставшегося внеклеточного матрикса стволовыми клетками пациента. Франсиско Фернандес-Авилес, главный кардиолог больницы Грегорио Мараньона в Мадриде, считает это новым этапом в развитии ксенотрансплантации.

Наши знания в области тканевой биоинженерии накапливаются и постепенно переходят в умение… В 2008 году были опубликованы результаты работы по воспроизведению первых этапов развития человеческого мозга. В 2011 году японские исследователи получили зачатки гипофиза и глазных бокалов. Пока речь идет только о выращивании мини-органоидов, потому что дальнейшие этапы их развития требуют сложного трехмерного окружения, которое, в свою очередь, тоже должно развиваться с ростом органа. В последующие годы ученым разных групп удалось получить мини-органоиды кишечника, желудка и почек.

Последнее достижение в этой области – органоиды сердца – принадлежит известному специалисту по созданию искусственных органов Энтони Атала – директору института регенеративной медицины Уэйк Форрест, который разработал технологии получения из стволовых клеток пациентов мочевого пузыря, уретры и влагалища. Сейчас во всем мире живут десятки людей с такими искусственными органами.

В 2005–2009 годах четырем девочкам с редкими патологиями, при которых половая система развивается неправильно, были пересажены искусственные влагалища. В 2014 году подросшие пациентки смогли жить нормальной половой жизнью. Уретру (мочеиспускательный канал) вживили пяти мальчикам, и операции также прошли успешно, без осложнений.

Кроме того, был разработан метод 3D-печати прототипа искусственной почки. Искусственная почка имела правильную форму, однако внутренняя структура прототипа даже близко не приближалась к сложности настоящего органа, которая совершенно необходима, чтобы почка выполняла свою функцию. Тем не менее, именно метод биопечати со временем позволит получать необходимые биологические микроструктуры органов.

Это направление активно развивает еще один знаменитый биоинженер – Габор Форгач. Под его руководством был создан первый коммерческий 3D-биопринтер, на котором уже напечатаны образцы многих тканей. Этот прибор под названием «Organovo» удалось создать в 2009 году. А уже в 2010 году на первом биопринтере напечатали человеческий сосуд, причем без каких-либо дополнительных каркасов. Чтобы сделать из клеток аналог чернил принтера, их помещают в специальный гель, который не позволяет стволовым клеткам «слипаться» раньше времени. Принтер печатает, как правило, не единичными клетками, а их шарообразными скоплениями – сфероидами (хотя метод позволяет использовать для печати иотдельные клетки, что необходимо для некоторых структур). Каждый напечатанный слой клеток отделяют слоем геля, а уже готовый орган отправляют дозревать в биореактор. При этом гель, использованный для печати, растворяется, а внутри органа развивается его сосудистая сеть. 3D-биопечать продолжает развиваться во всем мире: в том же 2010 году впервые удалось напечатать фрагмент кожи, а в 2014 – сердечный клапан и фрагмент ткани печени. Среди последних достижений следует отметить создание на биопринтере нервной ткани человека с точно позиционированными нейронами, что удалось сделать группе ученых под руководством австралийского биоинженера Гордона Уэлласа (это и есть тот самый случай, когда необходимо печатать ткань отдельными клетками, а не сфероидами).

И еще одно направление биоинженерии – органы на чипах. Его развивает Дональд Ингбер – автор идеи «органа на чипе» – простейшей клеточной системы, расположенной на пластинке стандартного размера и воспроизводящей основные функции моделируемого органа. Дональд Ингбер создал множество органов на чипах, и сейчас работает над объединением десяти таких органов в «человека на чипе». Орган на чипе представляет собой пластину с ячейками, заселенными клетками разных видов. Ячейки соединяются каналами, имитирующими кровоток или обмен тканевой жидкости между группами клеток «органа». Такое устройство в максимально компактной и контролируемой форме моделирует саму суть работы органа. На чипах уже удалось воспроизвести работу легких, почек, печени, кишечника с его микробиомом и перистальтикой, а также гематоэнцефалического барьера и гематопоэтической ниши костного мозга. Сейчас исследователи работают над созданием «человека на чипе» – то есть системы из всех жизненно важных органов, которая позволит изучить транспорт веществ в организме, а также влияние органов друг на друга.

Не остаются без внимания и проблемы косметологии. Группа ученых под руководством Такаси Цудзи из Научного университета Токио использовала стволовые клетки для создания волосяных фолликулов. Они вырастили «зародыши» волосяных луковиц, которые можно вживить в кожу. Биотехнологи использовали взрослые стволовые клетки, извлеченные из здоровых волосяных луковиц пациента, что исключает возможность развития реакции отторжения трансплантата.

Очевидно, что главная проблема тканевой и органной инженерии, которую еще предстоит решить, это создание высокоспециализированных клеток, упакованных биопринтером в оптимальную для функции органа пространственную структуру. Небольшой вклад в это общее дело вносит и наша лаборатория. Используя стволовые клетки из разных источников (табл. 1), мы пытаемся сделать их высокоспециализированными (табл. 2), применяя технологии направленной дифференцировки…