В последние десятилетия во всем мире и России отмечается заметный рост папилломавирусной инфекции (ПВИ) [5,6]. Имеются данные, что почти 8% здорового населения выделяют с мочой вирус папилломы человека 16 типа, а среди женщин, пациенток гинекологических клиник, этот показатель достигает 49% [4].

  Вирусы папилломы человека относятся к семейству паповавирусов (Papovaviridae) группы Papillomavirus (HPV).

  Это мелкие (диаметр вирусных частиц ~55 нм) ДНК-содержащие вирусы, не имеющие внешней оболочки и отличающиеся строгой эпителиотропностью, обладающие способностью поражать клетки эпителия эктодермального происхождения (кожа, слизистые половых органов, ротовой полости). Характерная особенность вируса заключается в способности вызывать пролиферацию эпителия кожи и слизистых оболочек [13].

  Геном вирусов папиллом представляет собой кольцевую (эписомальную) ДНК, содержащую до 8000 пар нуклеотидов, и состоит из восьми рамок считывания, кодирующих ранние (early) E6, E7, E1, E2, E4, E5 и поздние (late) — L1- и L2-функции. Поздние гены L1 и L2 кодируют структурные белки вириона. Три ранних гена Е1, Е2, Е4 контролируют функции, необходимые для репродукции вируса, причем Е2 обладает функциями регулятора транскрипции вирусной ДНК, которая начинается в регуляторной области URR (Upstream regulatory region). Гены Е5, Е6 и Е7 обладают активностью, стимулирующей пролиферацию и трансформацию клеток.

  Согласно действующей классификации, среди ВПЧ, наиболее часто вызывающих поражения аногенитальной области, выделяют типы с низкой онкогенностью (6, 11, 42, 43, 44), средней онкогенностью (31, 33, 35, 51, 52, 58) и высокой онкогенностью (16, 18, 45, 56) [12].

  На сегодняшний день роль вирусов папилломы человека в возникновении рака шейки матки (РШМ) общепризнанна, а данная нозология относится к заболеваниям, передаваемым половым путем, что отражено в пресс-релизе Всемирной организации здравоохранения в 1996 году [51].

  Онкогенный потенциал ВПЧ детерминирован следующими механизмами. В ходе опухолевой прогрессии кольцевой вирусный геном часто интегрирует в геном клетки путем разрыва ДНК и утраты генов E2, E4, Е5 и частично L2. В клеточный геном встраиваются регуляторная область URR и гены E6 и E7, которые постоянно экспрессируются в опухолевой ткани. Таким образом, в опухолевых клетках отсутствует продукция вирусных частиц, и для поддержания трансформированного фенотипа достаточно активности генов E6 и E7. Интеграция ДНК ВПЧ неспецифична, происходит в различные участки генома, часто в участки повышенной хрупкости хромосом. Длительное время интеграция вирусной ДНК рассматривалась как необходимое условие прогрессии цервикальных дисплазий в рак шейки матки. Однако эписомальная вирусная ДНК выявляется в значительном проценте случаев рака шейки матки (до 40%) [7]. Возможно смешанное присутствие в опухоли молчащей интегрированной вирусной ДНК и активно транскрибируемой эписомальной вирусной ДНК. В настоящее время механизм интеграции и ее значение активно изучаются.

  Трансформирующие свойства папилломавирусов обеспечиваются функционированием генов Е5, Е6 и Е7 [8, 53]. Продукт гена Е5 важен на ранних стадиях инфекции, так как транскрибируется только с эписомальной ДНК. Белок Е5 стимулирует клеточный рост, формируя комплексы с рецепторами эпидермального фактора роста и колониестимулирующего фактора CSF-1. Показано, что E5 может предотвращать апоптоз, вызванный повреждением ДНК ультрафиолетом [53]. Белки Е6 и Е7 многофункциональны, и их трансформирующий потенциал обеспечивается путем белок-белкового взаимодействия. Белок Е6 взаимодействует с белками р53 и BAK, вызывая их деградацию по убиквитинзависимому пути. Это приводит к предотвращению апоптоза и нарушению защитных регуляторных механизмов, обеспечивающих репарацию ДНК, что способствует дестабилизации генома. Кроме того, белок Е6 подавляет выработку интерферона, активирует теломеразу и предотвращает деградацию тирозинкиназ семейства SRC, таким образом усиливая пролиферацию [53]. Основным свойством белка Е7 является взаимодействие с продуктом гена Rb, с убиквитинизацией последнего и высвобождением из комплекса рRb-Е2F транскрипционного фактора Е2F, регулирующего клеточную пролиферацию [8]. Высокая активность фактора Е2F может привести к апоптозу в клетках, экспрессирующих Е7, так как при этом активируется синтез ингибитора циклинзависимых киназ р16INK4A. В пролиферирующих HPV-инфицированных клетках существует механизм защиты от малигнизации путем подавления функций вирусных онкобелков за счет ингибиторов циклинзависимых киназ, в первую очередь р16INK4A. Однако, несмотря на высокий уровень р16INK4A, этот белок остается функционально неактивным, так как Е7 также активирует циклины А и Е, стимулирующие вход в S-фазу клеточного цикла. Кроме того, Е7 блокирует функции ингибиторов циклинзависимых киназ р21WAF1/CIP1 и p27KIP1. Е7 также способствует дестабилизации хромосом и усиливает мутагенное действие химических канцерогенов. Как недавно показано, Е7 индуцирует анеуплоидию, вызывая амплификацию центриолей на ранних стадиях канцерогенеза.

  Каждый из генов Е6 и Е7 способен иммортализовать культуры клеток. Иммортализация клеток in vitro, то есть способность неограниченно долго пассироваться в культуре ткани, скорее всего, соответствует клинической стадии легкой дисплазии. Однако именно совместная экспрессия этих генов значительно усиливает прогрессию благодаря уникальному кооперативному эффекту трансформации двумя генами, Е6 и Е7. В ВПЧ-инфицированных клетках р16INK4A синтезируется, но не оказывает влияния на клеточный цикл, так как хотя р16INK4A нейтрализует Е6, белок Е7 минует это подавление, прямо активируя циклины А и Е. Е6 в свою очередь предотвращает Е7-индуцированный апоптоз, деградируя белки р53 и BAK. Поскольку накопление р16INK4A в клетках свидетельствует о трансформации вирусами папиллом, предложено выявлять такие клетки на гистологических срезах или в цитологических мазках по окраске специфическими антителами к р16INK4A [26].

  Функционирование вирусных онкобелков и интеграция ВПЧ вызывают дестабилизацию хромосом, что может быть причиной инактивации генов-супрессоров опухолевого роста. Гены-супрессоры инактивируются при нарушениях структуры обоих аллелей гена, что обычно происходит при сочетании делеции одного аллеля и мутации в другом. Поиск потенциальных генов-супрессоров заключается в обнаружении хромосомных локусов с высокой частотой аллельных делеций в опухолевой ДНК по сравнению с нормальной [9]. В дисплазиях наиболее ранние нарушения отмечены на хромосомах 3р, 6р, 11q, тогда как генетические изменения на 6q, 11р, 13, 18 ассоциированы с прогрессией инвазивного РШМ и образованием метастазов [7, 8, 29]. Более чем в 50% опухолей имеются аллельные делеции в районе 6р21.3, в котором располагаются гены HLA I класса [53]. Еще в 20% РШМ мутации в этой области сопровождаются нарушением экспрессии HLA–А/В антигенов I класса [26]. До сих пор открыто немного генов, участвующих в канцерогенезе шейки матки, среди них FHIT, RASSF1A, локализованные на 3р. Предпринимаются попытки выявления специфических генетических нарушений в цервикальных мазках в клетках шейки матки у ВПЧ-носителей до появления признаков морфологической атипии, что может иметь практическое значение на ранних стадиях заболевания, особенно в спорных случаях.

  В последнее время большое значение придается эпигенетическим изменениям в опухолях различной локализации, которые не затрагивают структуру гена, но вызывают нарушения экспрессии ряда клеточных генов. Такие изменения могут быть вызваны локальным гиперметилированием специфических последовательностей (богатых динуклеотидом СрG) в промоторах, регулирующих транскрипцию ряда генов, которые в нормальных клетках не метилированы [9]. Показано метилирование некоторых генов (например, FHIT, RARb2, RASSF1A) и при РШМ [7, 53].

  Вероятно, одной из важнейших причин устойчивости вируса папилломы к терапии и высокого показателя рецидивирования является способность ВПЧ модулировать местный и системный иммунный ответ, защищая вирус от элиминации эффекторами иммунной системы. Среди механизмов иммуносупрессивного действия ВПЧ можно выделить следующие:

  • Вирус не разрушает кератиноциты, в которых происходит его размножение, то есть не обладает цитопатическими свойствами, ограничивая тем самым выход вирус-специфических белков и контакт с АПК.
  • В развитии вирусной инфекции отсутствует фаза виремии, то есть генерализации инфекции, при которой происходит выброс вирионов в кровь, что способствовало бы распознаванию вирусной инфекции иммунной системой хозяина.
  • За счет особенностей генетического кода вируса синтез капсидных белков, обладающих хорошей иммуногенностью, протекает очень медленно и в малых количествах, тормозя таким образом развитие противовирусного иммунитета. Тогда как ранние белки Е6 и Е7 синтезируются активно и индуцируют процессы малигнизации инфицированных клеток.
  • Белок Е7 ВПЧ нейтрализует противовирусную и противоопухолевую активность интерферона-a2 за счет его способности избирательно блокировать большинство генов, индуцируемых интерфероном.
  • Белок Е7 инактивирует фактор регуляции активности интерферона IRF, который является фактором транскрипции генов, активируемых при действии на клетки интерферонов -a и -g. Посредством этого механизма вирус блокирует противовирусную активность эндогенных интерферонов при их физиологической концентрации.
  • Белок Е7 ингибирует экспрессию генов основного комплекса гистосовместимости, затрудняя распознавание опухолевых клеток иммунной системой хозяина.
  • Белок Е7 обладает выраженными иммуносупрессивными функциями, тормозя созревание антиген-презентирующих клеток.
  • Белок Е6 нейтрализует действие лимфокина IL-18, который играет важную роль в формировании иммунного ответа с участием CD8-лимфоцитов.
  • Белок Е5 вызывает закисление рН в эндосомах, препятствуя процессингу и эффективной презентации антигена дендритными клетками [12].

  Изучение уровня эндогенных ИФН-a и -g, показало, что у больных с ПВИ отмечается угнетение их выработки до 40% и 50% соответственно. А выявленные нарушения процессов ранней активации Т- и В-лимфоцитов (определялось по низкому уровню фосфатидилинозитидов на мембранах иммунокомпетентных клеток) были сопоставимы с показателями при опухолях челюстно-лицевой области [8, 53].

  Вопросы необходимости деструктивного лечения плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки низкой степени (LSIL-low grade squamous intraepithelial lesions), ассоциированных с вирусом папилломы человека, дискутируются [14]. Тактика в отношении LSIL, которые включают в себя субклинические формы папилломавирусной инфекции и CIN I, окончательно не определена. Это связано с тем, что после деструктивного лечения отмечается высокий процент рецидивов ввиду персистенции ВПЧ в тканях. Кроме того, в 30–50% случаев инфицирования наблюдается самопроизвольная регрессия [19].

  В контексте сказанного оправданным представляется применение препаратов интерферона, об эффективности которых есть ряд указаний в современной литературе [3, 6, 16, 25, 27, 28, 41, 47].

  Интерферон-альфа обладает выраженным противовирусным, противомикробным и иммуномодулирующим действием. Последнее проявляется в активации CD-8+ цитотоксических Т-лимфоцитов, NK-клеток, усилении дифференцировки В-лимфоцитов и продукции ими антител со сменой их изотипа и повышением аффинности, активацией моноцитарно-макрофагальной системы и фагоцитоза, а также усилении экспрессии молекул MHC-I, что способствует, в первую очередь, амплификации клеточно-опосредованных реакций иммунной системы, которые играют основную роль в противовирусной и противоопухолевой защите организма.

  Среди новых препаратов интерферона интерес представляет отечественный препарат Генферон в виде суппозиториев, который успешно используется в лечении урогенитальных заболеваний вирусной и бактериальной этиологии. Его основными компонентами являются интерферон человеческий рекомбинантный-альфа-2, таурин и анестезин [1].

  Принимая во внимание широкий спектр терапевтических эффектов данного препарата (иммуномодулирующее, противомикробное, противовирусное, репаративное, противовоспалительное, мембрано- и гепатопротекторное, антиоксидантное, нормализующее метаболические процессы действие), он представляется перспективным для лечения LSIL, ассоциированных с высокоонкогенными типами ВПЧ [1, 2].

  Для оценки эффективности данного препарата при лечении указанной нозологии в 2007 году было проведено сравнительное рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое клиническое исследование.

 

Цель исследования

Изучение терапевтической эффективности и безопасности препарата Генферон для лечения плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки низкой степени, ассоциированных с вирусами папилломы человека (ВПЧ) высокоонкогенного риска, по данным цитологического исследования цервикальных мазков и кольпоскопии, а также оценка возможности элиминации ВПЧ по данным Digene-теста.

 

Материалы и методы

Исследование было выполнено на базе Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии Росмедтехнологий в течение 2007 года.

  В исследовании участвовали 40 женщин, инфицированных ВПЧ высокоонкогенного риска по данным Digene-теста, результаты цитологического исследования у которых свидетельствовали о наличии LSIL (в соответствии с классификационной системой Бетесда).

  Для лабораторной диагностики ВПЧ-инфекции применялся Digene-тест — единственный метод, одобренный FDA для цервикального скрининга и лицензированный Федеральной службой РФ по надзору в сфере здравоохранения и социального развития; осуществлялся в лаборатории иммунологии Центра (руководитель — академик РАМН, профессор Г. Т. Сухих).

  Для проведения ПЦР-диагностики использовались сертифицированные тест-системы. Забор материала для проведения исследований производился в одно и то же время суток (утром).

  Пап-тест — микроскопическое исследование шеечного мазка на атипичные клетки, взятого с помощью специальных щеток — эндобрашей и шпателей, проводился в лаборатории патоморфологии Центра (руководитель — профессор Н. И. Кондриков).

  Кольпоскопия проводилась при помощи кольпоскопа фирмы Leisegang (Германия), с использованием традиционных сосудистых тестов и увеличением x7,5, x15, x30.

  Критериями включения в исследование были возраст 18–50 лет, наличие интраэпителиального поражения шейки матки низкой степени (LSIL) по данным цитологического исследования цервикального мазка, наличие ВПЧ высокоонкогенного риска по данным Digene-теста; способность выполнять требования протокола; предоставление письменного информированного согласия. Критериями исключения были беременность; тяжелые нарушения функции сердца, легких, печени и почек в стадии декомпенсации; гиперчувствительность к интерферону или другим компонентам препарата, которая устанавливалась по данным анамнеза или в момент первого введения препарата; прием противовирусных или иммуномодулирующих препаратов в течение 3 предшествующих месяцев; наличие более тяжелой патологии шейки матки; подтвержденная ВИЧ-инфекция; наличие психоневрологических заболеваний. До начала исследования было получены одобрения Федеральной службы РФ по надзору в сфере здравоохранения и социального развития, Национального и Локального этических комитетов.

  Проводилось скрининговое обследование амбулаторно наблюдаемых женщин, включающее пап-тест. В случае выявления признаков LSIL (выявление койлоцитоза, многоядерности клеток, дискератоцитоза, дискариоза и т. п.), женщину знакомили с условиями проведения исследования (скрининг-визит). При ее согласии участвовать в исследовании и выполнять его условия подписывалась форма информированного согласия, одобренного регуляторными органами, и проводилось взятие материала для выявления вируса папилломы человека (ВПЧ) методом Digene. В случае выявления ВПЧ высокого онкогенного риска по данным Digene-теста и соответствия другим критериям включения, пациентка включалась в исследование. У всех пациенток, включенных в исследование, проводились кольпоскопия, бактериоскопический анализ содержимого влагалища, ПЦР-диагностика вируса простого герпеса I и II типов (ВПГ1+2), цитомегаловируса (ЦМВ) и Chlamydia trachomatis в соскобе эпителия цервикального канала и шейки матки (визит 1).

  По результатам проводимой рандомизации (выбор одной из двух серий суппозиториев методом случайных чисел) включенным в исследование пациенткам назначались исследуемый препарат или плацебо. Введение суппозиториев Генферон, содержащих 500 000 МЕ интерферона-a, или внешне не отличимых от них суппозиториев плацебо, не содержащих ИФН-a и таурин, осуществлялось интравагинально 2 раза в сутки в течение 10 дней с последующим назначением 1 раз в сутки через день в течение 3 месяцев.

  На протяжении всего исследования женщины использовали барьерные методы контрацепции и вели дневник, в котором отмечались побочные эффекты терапии, их выраженность и продолжительность.

Через 3 месяца (визит 2) после первого введения суппозиториев проводились пап-тест, кольпоскопия, Digene-тест на ВПЧ высокого онкогенного риска, бактериоскопический анализ содержимого влагалища, осуществлялась ПЦР-диагностика на другие инфекции в соскобе эпителия цервикального канала.

  Через 6 месяцев (визит 3) женщинам, включенным в исследование, проводились пап-тест, Digene-тест и кольпоскопия, проверялись дневники, где были записаны все препараты, которые пациентки принимали на протяжении исследования с момента подписания информированного согласия до заключительного визита. Оценивались локальные и системные эффекты, которые могли бы быть связаны с использованием препарата. Переносимость и безопасность препарата оценивались по частоте и выраженности нежелательных явлений.

  Возможность досрочного выбывания из исследования была предусмотрена на любом этапе клинических испытаний — как по инициативе пациентки, так и по инициативе исследователя. Причины выбывания указывались в истории болезни и индивидуальной регистрационной карте (ИРК). В случае проведения хирургического лечения плоскоклеточного интраэпителиального поражения шейки, а также применения противовирусных препаратов в процессе исследования, пациентка исключалась из исследования.

   ИРК пациенток заполнялась на основании опроса и осмотра, данных клинического обследования и лабораторных исследований.

  По завершении исследования формировались два массива данных, которые подвергались анализу.

  Критериями эффективности применения препарата являлись:

  • регресс ВПЧ-ассоциированных изменений шейки матки по данным пап-теста и кольпоскопии;
  • достижение отрицательного результата Digene-теста на ВПЧ высокого онкогенного риска.

  Полученные у обследованных пациенток показатели обрабатывали методами вариационной статистики, использовались описательная статистика и непараметрический анализ данных (Mann-Whitney U Test, Kolmogorov-Smirnov Test). Для статистического анализа частотных показателей использовался метод углового преобразования Фишера (вычисление ФИ* критерия) [48]. Различие между сравниваемыми величинами признавалось достоверным при p<0,05.

 

Продолжение статьи читайте в следующем номере

 

Список литературы находится в редакции

 

  1. Впервые статья была опубликована в издании «Эффективная фармакотерапия в акушерстве и гинекологии»,
    2009 — № 4, август, с.36-41.