Фармакология и клинические показания

 

 Wuttke, H. Jarry, V. Christoffel, B. Spengler, D. Seidlova-Wuttke

 Введение

Многие предменструальные симптомы, в частности, предменструальная масталгия (мастодиния) соотносятся с латентной гиперпролактинемией (Jarry et al., 1994; Wuttke et al., 1997; Jarry et al., 1999). Такие пациентки не страдают от пролактиномы, но в качестве реакции на ежедневные стрессовые ситуации у них происходит повышенная секреция пролактина, что, видимо, стимулирует работу молочных желез как напрямую, так и через нарушение эстроген-прогестеронового равновесия, что в свою очередь, вызывает мастодинию. В предменструальный период у таких пациенток часто наблюдается повышенный уровень сывороточного пролактина (Jarry et al., 1999).

Выделение гипофизарного пролактина находится под влиянием тонизирующего гипоталамического торможения дофамином, выделяемым тубероинфундибулярными нейронами дофамина в воротные вены, соединяющие гипоталамус с гипофизом.

Таким образом, мы пришли к выводу, что особенно во время предменструального периода дофаминергическое ингибирование является недостаточным настолько, что под действием ежедневных стрессов возникает гиперпролактинемия. Следовательно, при лечении предменструальной масталгии было предложено мягкое эффективное ингибирование дофаминергическими факторами.

Несомненно, синтетический агонист дофамина (бромокриптин) также оказал положительное влияние на боли в груди, болезненность и тяжесть, и такое улучшение связывается с пониженным уровнем сывороточного пролактина (Mansel and Dogliotti, 1990). Не только предменструальная масталгия, но также другие соматические и психические симптомы, такие как предменструальная депрессия, грусть, раздражительность, эмоциональная реактивность и сенсорная чувствительность, улучшились путем применения другого синтетического агониста дофамина – лизурида (Schwibbe et al., 1983). Отсюда, было выяснено, что также небольшая недостаточность других дофаминергических структур мозга, таких как нигростриарные и мезолимбические системы, могут быть причинно связаны с предменструальными симптомами.

Клинический опыт показал, что не только предменструальная масталгия, но также и нарушения цикла можно эффективно лечить при помощи экстракта Vitex Agnus Castus (AC) (Milewicz et al., 1993; Roeder, 1994; Lauritzen et al., 1997; Gerhard et al., 1998; Halaska et al., 1999). Следовательно, мы предложили, чтобы экстракты АС содержали дофаминергические соединения (Jarry et al., 1991; Jarry et al., 1994). В описанных ниже фармакологических и клинических исследованиях постоянно использовался специальный экстракт АС BNO 1095, стандартизованный по содержанию некоторых дитерпенов, обладающих допаминергической активностью (Bionorica SE, Ньюмаркт, Германия). BNO 1095 является основной активной субстанцией доступных на рынке таблетированной формы и жидкого средства Agnucaston®, Mastodynon.

 

Материал и методика, результаты и обсуждения

Ранее мы искали дофаминергические соединения в этом экстракте и, более того, были способны идентифицировать некоторые доли, связывающие рекомбинантные дофаминовые рецепторы и подавляющие выделение гипофизарного пролактина. Дофаминергическая активность присутствовала в полярных и неполярных фракциях. Экстрагируемые дофаминергические соединения (этанол 50%) могут быть выделены по молекулярным массам и разделены на 3 фракции (PI, P2 и P3). Если в искусственных условиях дофаминовые рецепторы культивируются с радиоактивно мечеными лигандами, связывающимися с этими рецепторами, такими как сульпирид, соединения во всех 3 фракциях замещают радиоактивный лиганд, связанный с  рецептором в зависимости от дозы, и это достигает 3 пиков со связывающим действием допаминового рецептора, в котором Р3 составляет наибольшее количество веществ (рис. 1). Во время экспериментов «in vitro» выращивались клетки гипофиза в суспензии, и они выделяли высокие количества пролактина (базальный уровень), поскольку питательная среда не содержала никаких дофаминергических субстанций. Когда к культуре добавлялись дофамин или дофаминергические соединения, выделение пролактина лактотрофами ингибировалось в зависимости от концентрации, поскольку в радиорецепторном анализе P3 была самая активная фракция для ингибирования выделения пролактина (рис. 2). 

Попытка очистить эту (эти) вещество (а) из Р3 окончились неудачей, поскольку любой этап очищения приводил к разрушению инактивации субстанции (й); дофаминергическая активность исчезала по причине высокой лабильности  (Wuttke et al., 1995).

В более ранних попытках провести очистку дофаминергических соединений из экстрактов Vitex Agnus Castus (BN01095) нам и другим авторам удалось идентифицировать количество дитерпенов (Christoffel et al., 1999; Hoberg et al., 1999).

Выраженные дитерпены, найденные в экстракте Vitex Agnus Castus, это ротундифуран (P-107) и 6b, 7b-диацетокси-13-гидрокси-лябда-8,14-диен (=B 110).

Эти два соединения также были описаны Hoberg et al., (1999). В дополнение к этим дитерпенам мы идентифицировали еще 3 соединения типа лябдена, структура и химические названия которых приведены на рис. 3. Не так давно нам удалось химически идентифицировать самые активные вещества в неполярной фракции BN0 1095. Предлагаемые структуры веществ показаны на рис. 4. Были идентифицированы шесть тесно связанных дитерпенов со скелетом клеродана, пять из которых имеют структуру клерода-x,14-диен-13-ол и один имеет структуру клерода-x,y-14-триен-13-ол.

Окончательная структура этих соединений, включая абсолютную стереохимию, все еще нуждается в прояснении для проверки точного расположения двойных связей в кольце A или B, соответственно. 

Активность этих веществ тестировалась в анализе дофаминового рецептора (рис. 5). Самым активным соединением оказался B115, из которого 1 мольM имел связующее действие, эквивалентное 218 нM допамина (DA).

Итак, дофамин оказался приблизительно в 4–5 раз активнее по замещению своего радиоактивного лиганда в D2-рецепторных препаратах, чем B115. Клеродадиенолы были несколько менее активны, чем B115 (активность составила прибл. 1/8 от активности дофамина), но как показано на рис. 6, их количество на один грамм сухого экстракта  Vitex Agnus Castus было настолько высоким, что их общая дофаминергическая активность была прибл. в 5,7 раз выше, чем активность B115.

Фактически, общая дофаминергическая активность клеродадиенолов составила более 50% от всей дофаминергической активности других соединений. Отсюда, самыми основными дофаминергическими соединениями в специальном экстракте BN01095 являются клеродадиенолы.

Клеродадиенолы также являются активными ингибиторами выделения пролактина. При концентрации в 86 раз выше молярности, чем у дофамина, они ингибируют выделение пролактина более основательно, чем 10-6 M дофамин. Половина концентрации (в 43 раза больше, чем у дофамина на основе молярности) клеродадиенолов были несколько менее эффективны, чем 10-6 M дофамина (рис. 7). 

Выделение пролактина стимулировалось высокими внутриклеточными уровнями циклического аденозинмонофосфата. Дофамин действует посредством аденилциклазы дофамин-ингибирования, поэтому он ингибирует производство циклического аденозинмонофосфата. Форсколин – это стимулятор производства циклического аденозинмонофосфата и, следовательно, стимулирует выделение гипофизарного пролактина. Как показано на рис. 8, это выделение циклического аденозинмонофосфата при стимуляции форсколином может эффективно подавляться дофамином и клеродадиенолами. Кроме того, клеродадиенолы были приблизительно одинаково активны по сравнению с дофамином при концентрации приблизительно в 50 раз выше.

Рис. 9 детально демонстрирует, что ротундифуран, первый из опубликованных дитерпенов с дофаминергической активностью (Hoberg et al., 1999) при концентрациях, когда клеродадиенолы были очень активными в подавлении выделения пролактина, не оказывал никакого действия на секрецию этого гормона лактотрофами. 

Поскольку клеродадиенолы очень стабильны и стойки почти к любому лечению, это контрастирует со стабильностью дофамина и других дофаминергических соединений. Следовательно, можно сделать вывод, что основную дофаминергическую активность в специальном экстракте BNO 1095 составляют дитерпены, из которых клеродадиенолы выполняют наиболее заметную роль дофаминергической активности.

Основательные клинические данные по эффекту, оказываемому препаратами Аgnus Сastus на предменструальные синдромы или на выделение гипофизарного пролактина, имеются в недостаточном количестве. Большинство опубликованных на эту тему исследований были или не слепые и/или не плацебо-контролируемые.

В двух недавних клинических исследованиях была установлена эффективность доступного на рынке специального экстракта Vitex Agnus Castus – BNO 1095 по действенному снижению предменструальной мастодинии. Соответственно, пациентки должны были заполнить визуальную аналоговую шкалу (ВАШ), в которой можно было оценить имеющуюся у них боль в груди по шкале от 0 мм (самая незначительная масталгия) до 10 мм (очень сильная).

 Результаты самооценки показаны на рис. 10. Оба препарата (Мастодинон в таблетированной форме и растворе) понизили показатели масталгии на 35–40%, что означает значительно более сильный эффект, чем у плацебо (25%) (Wuttke et al., 1997; Halaska et al., 1999). В одном из таких исследований (Wuttke et al., 1997) также приводилась информация о том, что препарат AC понижает уровень выделения сывороточного пролактина (рис. 11). 

Недавно нам удалось взять повторяющиеся заборы образцов крови у пациенток, страдающих от предменструальной мастодинии. Этим пациенткам был поставлен катетер в латеральную подкожную вену руки, и заборы образцов крови производились непосредственно после этого с интервалом в 10 мин. на протяжении 10 часов. Информация относительно одной из таких пациенток показана на рис. 12. В результате стресса от венопункции, гипофиз этой пациентки выделял большое количество пролактина, который достиг такого уровня, который, несомненно, входит в рамки патологического. Во время фазы лютеинизации импульсы ЛГ появлялись регулярно с интервалом от 3 до 4 часов, что также наблюдалось у этой пациентки. Эти импульсы ЛГ связаны с импульсами пролактина, пиковые значения которого также четко находились в рамках патологических значений. У этой пациентки уровни прогестерона и эстрадиола были в диапазоне, указывающем на недостаточность желтого тела. После трехмесячного лечения при помощи доступного на рынке препарата AC Мастодинон,  супрафизиологичское выделение пролактина вследствие стресса и импульсы пролактина, связанного с импульсами ЛГ, нормализовались и, как результат, импульсы ЛГ не вызывали повышение уровней прогестерона и эстрадиола, также уровни базального протестерона и эстрадиола были в пределах нормы.

Детальная информация про пульсирующую секрецию ЛГ с параллельными циклами и важность ЛГ и пульсирующую секрецию пролактина были недавно рассмотрены Wuttke et al., (2001). 

Тот факт, что эти дитерпены связываются с допаминовыми рецепторами 2 типа и таким образом подавляют выделение гипофизарного пролактина и что они являются высоко липофильными, говорит о том, что они могут легко проходить через гематоэнцифалический барьер. Таким образом, у них появляется доступ к другим допаминергическим системам головного мозга и их постсинаптическим рецепторам, которые формируют нигростриарную и мезолимбическую допаминергическую системы (рис. 13). Эти системы участвуют в регулировании опорно-двигательной и поведенческой активности.

Таким образом, положительное влияние NBO 1095 – специального экстракта Vitex Agnus Castus, в особенности найденных там дитерпенов, – может стимулировать эти постсинаптические рецепторы и посредством этого модулировать часто наблюдаемые опорно-двигательную и поведенческую нестабильность.

Клинические наблюдения показывают, что экстракт VAC может иметь положительное влияние на лечение при жалобах климактерического периода. Следовательно, мы изучали экстракт BN01095 на предмет гипотетической эстрогенной активности. Более того, экстракты VAC содержали вещества, которые вытесняют радиоактивно меченный эстрадиол из препарата цитозольного рецептора эстрогена (рис. 14). Внутриклеточные рецепторы, два из которых – клонированные, получили соединение с «эстрогеном». Старый, хорошо изученный эстрогеновый рецептор теперь носит название «эстрогенный рецептор a» (ЭРa). Новый эстрогенный рецептор – это ЭРb (Kuiper et al., 1996). Функции ЭРa относительно хорошо определены: стимулирование пролиферации миометрия и эндометрия; на уровне скелета, воздействие эстрадиола, предотвращающее развитие остеопороза, что достигается посредством ЭРa. Предположительно, защитное влияние на сердечно-сосудистую систему также, видимо, достигается посредством ЭРa (критическую статью см. у Couse and Korach, 1999). Менее известно о физиологическом значении ЭРb. Согласно работам Gustafsson и его коллег (Makela et al., 1999; Weihua et al., 2000), влияние ЭРa и ЭРb противодействуют друг другу (так называемая теория инь-ян).

Таким образом, вещество, связанное исключительно с ЭРb, вызывает пострецепторную транскрипционную активацию, может стать желанным инструментом для изучения физиологии ЭРb и, возможно, применимости агонистов ЭРb при лечении эстрогензависимых опухолей.

При попытке более детально охарактеризовать гипотетические эстрогенные вещества в специальном экстракте прутняка BNО 1095 использовались рекомбинантные белки эстрогенного рецептора-a и эстрогенного рецептора-b. Хотя эстрогенные компоненты в экстракте AC не связаны с белком ЭРa, однако, было очевидным наличие специфического связывания для эстрогенного рецептора подтипа b. Недавно мы идентифицировали апигенин, флавоноид, в качестве основного компонента, с четко агонистической активностью по отношению к эстрогенному рецептору подтипа b.

Апигенин хорошо известен как растительный компонент, но впервые он был определен в составе экстракта Vitex agnus castus. В более ранней публикации Kuiper et al., (1998) уже демонстрировали высокую активность апигенина по связыванию ЭРb. Удивительно, однако, хотя IC50 для ЭРa невозможно было определить из-за слабой связи с ЭРa, способность апигенина к трансактивации в ЭРa-трансфицированных клетках была идентичной ее способности к трансактивации ЭРb (Kuiper et al., 1998).

В соответствии с теорией инь-ян Густафссона (Gustafsson), ЭРa и ЭРb имеют противоположные функции.

Таким образом, чистый агонист ЭРb не должен воздействовать на матку, поскольку матка содержит, главным образом, ЭРa. Более того, нам удалось показать, что экстракт VAC, принимаемый при острых (6 ч.), подострых (7 дней) или хронических течениях заболевания (3 месяца) в 2 различных дозах не имел влияния на вес матки или на регулирование любых генов матки, известных как эстроген-контролируемые.

После 3 месяцев орального применения, однако, нам удалось наблюдать небольшой, статистически незначительный эффект защиты от остеопороза (рис. 15) и заметное, схожее на эстрадиол, влияние на паратибиальные жировые отложения при использовании компьютерной томографии (рис. 16).

Как результат сниженного накопления жира в ответ на хроническое (3 месяца) лечение при помощи эстрадиола или Vitex Agnus Castus, уровень  сывороточного лептина (гормон, вырабатываемый липоцитами) также значительно понизился по сравнению с уровнем у крыс, которых кормили пищей, не содержащей фитоэстроген (рис. 17). 

В соответствии с небольшим, незначительным антиостеопоротическим влиянием, оказываемым ЭРb – под  действием экстракта Vitex Agnus Castus не наблюдались значительного влияния на маркеры костного метаболизма в сыворотке, такие как остеокальцин и костно-специфическую щелочную фосфатазу.

 Таким образом, мы показали, что экстракт Vitex agnus castus BNO 1095 содержит дофаминергические вещества, которые подавляют выделение гипофизарного пролактина, одно из которых является несколько менее активным, чем дофамин, при подавлении выделения пролактина в культивируемых клетках гипофиза. Это вещество было идентифицировано химически как клеродадиенол. Доступный на рынке препарат специального экстракта АС – BNO 1095, протестированный клинически, был успешно использован у пациенток, страдающих от предменструальной масталгии. Кроме того, данный экстракт содержит вещества с агонистической селективностью относительно подтипа b эстрогенного рецептора, который оказался вовлеченным в регулирование жировой ткани, но который не оказывает эстрогенного влияния на матку и имеет минимальное влияние на скелет.