Пропонуємо вашій увазі нову рубрику «Дивовижний світ науки», яку спільно будуть вести автори науково-популярного порталу «Моя наука». Портал створений для того, щоб з'являлося більше зрозумілих та якісних текстів українською мовою про наукові досягнення та відкриття, про українських дослідників. Тому й автори цієї рубрики – українські науковці у галузі біології та медицини. А для початку спробуємо поговорити про цікаве всім: про котиків і про сперматозоїди. Хоча за цими образами прихований складний і дивовижний світ внутрішньоклітинної фізико-хімічної біології. Приємного читання!

 

Щоб поворухнути рукою чи ногою, нашому організму треба запустити цілу низку складних клітинних процесів. Нескінченні хімічні реакції в мільйонах клітин призводять до появи електричного сигналу, який від нервових центрів мчить по нервах до м'язів та призводить до їх скорочення. Зв'язувальна ланка між електричними й хімічними подіями – іони кальцію, що запускають різноманітні клітинні процеси, як то скорочення м'язів чи передачу електричного сигналу між двома нервовими клітинами. А що робить маленький сперматозоїд, який має постійно рухати своїм хвостом, але жодних м'язів чи нервів у ньому немає? Виявляється, те ж саме: генерує електричні струми та впускає кальцій усередину 

Олексій Болдирєв, портал «Моя наука» my.science.ua

Звідки ж беруться електричні струми в клітинах? Щоб запалити світло ліхтарика, ми натискаємо на кнопку. Замикається контакт, електричний потенціал батарейки викликає струм, який тече по ланцюгу та живить лампочку. У нас у побуті струм – це потік електронів, негативно заряджених часточок. Від «мінуса» батарейки струм тече до «плюса». Треба тільки з’єднати їх дротинкою або іншим провідником. Навіть вологою ганчіркою. В кожній клітині теж є така батарейка: це клітинна мембрана. Всередині клітини зібралися негативні заряди клітинних біологічних кислот – це «мінус». Ззовні до них хочуть дістатися, тяжіють позитивно заряджені іони металів – натрію і кальцію. Але їм не зустрітися ніколи, не пустити струм, бо вони розділені інертною перепоною – ліпідною мембраною.

Жирна, гідрофобна мембрана непроникна для води та іонів, які є носіями струму. Щоб з’єднати два полюси «мембранної батарейки», треба відкрити в мембрані дірочку, через яку підуть гідрофільні заряджені частинки.

Цю функцію виконують особливі білки – іонні канали. Вони пронизують мембрану наскрізь, сполучаючи два її боки. Всередині білка знаходиться пора, вузький каналець діаметром декілька ангстрем – менше мільйонної частки міліметра.

Принцип роботи всіх іонних каналів дуже простий: пора може бути відкритою та закритою. Спеціальні частини білка, які називають воротами, відкривають і закривають пору, «вмикаючи» або припиняючи електричний струм через мембрану. Механізми відчинення каналу дуже різні як за механікою, так і за енергією, що призводить до руху воріт.

Ворота каналів відчиняються у відповідь на приєднання до білка хімічних молекул, на зміну електричного потенціалу (більше чи менше певних заряджених частинок поблизу мембрани), на деформацію самої мембрани, світлову хвилю, зміну температури або кислотності, на осмотичні рухи тощо. Будь-який сигнал, який приходить до каналу, перетворюється ним на електричний струм. А ось уже клітинні системи реагують на цей струм, «зчитують» його та відповідають запуском хімічних реакцій, вмиканням чи вимиканням генів, переміщенням молекул і органел та іншими доступними засобами.

Іонні канали зазвичай є складними білками, які складені з багатьох білкових субодиниць. Деякі з них, головні чи основні, утворюють власне стінки каналу – тунель крізь мембрану, його найвужче місце – селективну пору, ворітні механізми та зовнішньоклітинну й цитоплазматичну поверхні білкового комплексу. Інші, додаткові, приєднуються до основних та регулюють їх роботу, зв'язують сигнальні молекули, поліпшують чи погіршують роботу воріт, тощо.

На відміну від нашого ліхтарика, головні струми нашого організму переносяться позитивно зарядженими частинками: іонами натрію, калію і кальцію. Спеціальні білкові насоси весь час підтримують «мембранну батарейку» зарядженою. «Плюси» натрію і кальцію виганяються назовні, а «плюс» калію накопичується всередині клітини, надійно скомпенсований «мінусом» великих кислот. На підтримання цієї різниці електричних зарядів на мембрані – як за назвою, так і за знаком – наші клітини витрачають аж близько 30% всієї енергії, яку ми споживаємо! Вигода з такого нібито розтринькування з’являється за допомогою особливого механізму всередині пори каналів. Там є фільтр, який може пропускати одні іони, а інші відбраковувати. Тому є канали, що проникні до негативних іонів (аніонні), і ті, які пускають лише «плюси» (катіонні). Натрієві канали пропускають натрій, калієві – калій і так далі. Це дозволяє більш вибірково сприймати сигнали.

Поруч можуть стояти чутливий до вигинів мембрани кальцієвий канал, натрієвий канал, який відкривається у відповідь на зміну електричних потенціалів, та калієвий канал, що реагує на хімічні молекули.

Як дізнатися про наявність тих чи інших каналів у певній клітині? Для цього розроблена ціла низка дуже тонких методів, серед яких найпотужніший – «петч-клемп», за розробку якого отримали Нобелівську премію з фізіології чи медицини німці Берт Сакманн та Ервін Неєр.

Слід сказати, що у кінці 70-х років ішли перегони між німецькою та київською групою клітинних біофізиків Платона Костюка та Олега Кришталя за винайдення техніки, щоб дозволяла вимірювати найслабші клітинні струми. Спочатку вперед вирвалися кияни, запропонувавши метод заміни внутрішньоклітинних іонів за допомогою тоненьких пластикових трубок, який був опублікований в журналі Nature та використовувався по всьому світі. А потім німецькі колеги зробили ставку на скляні мікропіпетки – та досягли успіху.

Суть методу «петч-клемп» – присмоктування до клітини, що лежить під мікроскопом, тонким (діаметром 1–3 мікрометрів) скляним мікроелектродом, заповненим сольовим розчином, подібним до іонного складу цитоплазми, відривання маленького шматочка ("patch" з англійської «клаптик», «шматочок тканини») клітинної мембрани, а потім підтримання ("clamp"  з англійської «затискач», "фіксація") в клітині певного електричного потенціалу за допомогою спеціальних підсилювачів та трансформаторів струму. Отже, дослідник має дуже акуратно підвести кінчик електроду до поверхні клітини, обережно дозволити склу доторкнутися та прилипнути до мембрани, а потім відірвати маленький клаптик, щоб утворився отвір, контакт між цитоплазмою та рідиною електрода. Уявили філігранність роботи? Тим не менше, саме цим методом було встановлено наявність іонних каналів у найрізноманітніших клітинах.

Але то були клітини, які нерухомо лежать, прикріплені до скельця, у камері мікроскопа. А що ж робити зі сперматозоїдом, фізіологічною особливістю якого є постійний рух? За хвоста його не вхопиш. Спеціалісти з «петч-клемпу» більше 20 років вважали, що це неможливо. Лише 2006 року вийшла стаття в журналі Nature, де дослідники описали спосіб «запетчити» – як кажуть на своєму жаргоні електрофізіологи – сперматозоїд і виміряти нарешті його струми. Не зайвим буде відмітити, що головним виконавцем цього дослідження й автором статті був учень уже вищезгаданого київського академіка Олега Кришталя біофізик українського походження з Каліфорнії Юрій Киричок.

Що вигадали Киричок з колегами, щоб зловити невловимого сперматозоїда? Голівка не піддавалася контакту з електродом, як і хвіст через наявність підмембранних ригідних структур цитоскелету. Ті ж проблеми мала проміжна частина – шийка сперматозоїда. Рішення знайшли таке: під час останньої стадії дозрівання сперматозоїда та формування зрілої гамети, сперматоцит-попередник втрачає частину цитоплазми. Залишок цитоплазми ковзає по клітині й у певний час (майже перед самою еякуляцією) відбруньковується від сперматозоїда. Цей пухирець не має жорсткого підмембранного цитоскелету, а також з'єднаний електрично з усім внутрішнім простором клітини. Саме там біофізикам і вдалося утворити потрібний щільний контакт зі скляним електродом.

Перші ж експерименти показали, що сперматозоїди мають у своїй мембрані абсолютно новий, невідомий раніше іонний канал. Цей канал був катіонний, тобто пропускав крізь себе позитивно заряджені іони, але при цьому віддавав перевагу саме іонам кальцію. Цікаво, що струм через цей канал збільшувався за умов залужнення внутрішньоклітинного середовища. Канал був названий CatSper (від англ. "cation" – катіон, хоча також там читається "cat" – кіт).

Вже на самому початку дослідження каналу CatSper стало зрозуміло, що він є необхідним компонентом процесу запліднення. Генетичний нокаут (виключення) цього гену викликав безпліддя у самців мишей, хоча самиці залишалися фертильними. Жодних інших порушень у нокаутних тварин не було зареєстровано. У подальшому були відкриті ще три білки (CatSper2, CatSper3 і CatSper4), які також є основними пороформувальними субодиницями каналу. Знайдено й 3 додаткові субодиниці (названі грецькими літерами бета, гама й дельта на противагу чотирьом альфа-субодиницям).

Всі 7 складових іонного кальцієвого каналу CatSper виявилися абсолютно необхідними для нормальної функції сперматозоїда, а мутації в них призводили до нездатності сперматозоїда запліднити яйцеклітину як в експериментальних тварин, так і в людей, що є носіями таких мутацій. Але ж чому?

Наші м'язи скорочуються тому, що рухається тонка фібрила актину відносно товстої фібрили міозину. Цей рух енергозатратний, тому для нього потрібне розщеплення молекули АТФ з виділенням енергії. А ще активні центри на актиновому філаменті прикриті спеціальним білком тропоміозином, який відкриває їх за наказом головного регулятора – іону кальцію.

У сперматозоїда механізми, що рухають його хвостик, побудовані з інших білків, але принцип їх дії точно так же залежить від АТФ і кальцію. Хвіст сперматозоїда є по суті джгутиком, який швидко рухається за допомогою білкових моторів. Ці мотори споживають АТФ у якості енергетичного ресурсу та пригнічуються кислим pH, тому цитоплазма рухливого сперматозоїда має містити мінімум іонів водню: бути нейтральною або навіть трохи залужненою.

На відміну від м'язів, швидкі рухи хвоста з'являються при відсутності або дуже низькій кількості іонів кальцію всередині клітини. Проте не завжди швидкі помахи весла рухають швидше човен – це знають досвідчені гребці. «Знає» це й сперматозоїд. Для проникнення по в'язких жіночих статевих шляхах до яйцеклітини для запліднення йому потрібні не просто швидкі, а потужні рухи хвоста-джгутика. Для цього треба, щоб молекулярні мотори (білки-дінеїни) працювали з різною активністю з протилежних боків хвоста. Тоді джгутик здійснює асиметричні рухи, які викликають створення ним потужної хвилі, що сильно штовхає сперматозоїд уперед. Оскільки мотори з усіх боків у нормі працюють у нормі однаково, потрібно пригальмувати їх з одного боку. Це роблять спеціальні кальцій-чутливі білки калаксини, які у присутності іонів кальцію пригнічують роботу дінеїнів. А ось кальцій заходить у першу чергу (хоча й не винятково) через наш CatSper.

Перші дослідження «електричного кота» CatSper були проведені на сперматозоїдах мишей. Виявилося, що відкриття воріт цього каналу відбувається у відповідь на збільшення значення внутрішньоклітинного pH – залужнення цитоплазми сперматозоїдів. Поки сперматозоїди знаходяться на виході з сім'яників, pHу них кислий – близько 6. Багато протонів у міжклітинній рідині епідідімусу, багато протонів виробляється при розщепленні глюкози в самій клітині, багато протонів виділяють ферменти, які споживають АТФ-заряди в балансі, спеціальний протонний канал не здатний виводити з клітини протони. Але варто сперматозоїдам випасти до сім'явивідних проток, одразу pH зростає, протони перестають пригнічувати роботу моторів хвоста-джгутика – і ось сперматозоїди ожили, почали рухатися. Заодно те ж зменшення протонів відкриває і канали CatSper, які при потраплянні до статевих шляхів жінки з ще більшим pH спричиняють цілу хвилю внутрішньоклітинного кальцію – гіперактивують сперматозоїд, примушують битися хвіст, як батіг. Проте це все в мишей, а як у нас, людей?

До справи долучилася ще одна учениця Олега Кришталя, теж киянка в Каліфорнії – Поліна Лішко. Вимірявши струми в чоловічих сперматозоїдах, вона звернула увагу на те, що навіть сильне підвищення pH до 9 і вище, яке за фізіологічних умов трапляється дуже рідко, відчиняє ворота CatSper людини значно гірше, аніж у каналі миші. Не вистачало чогось ще, якогось додаткового фактору. І цей фактор був знайдений.

Виявилося, що канал людини відкривається ще й у відповідь на жіночий гормон прогестерон. Цей гормон активно виділяється кумулюсними клітинами навколо ооцита, тому його концентрація зростає по мірі наближення сперматозоїда до заповітної мети. А значить, і все більше кальцію входить через CatSper, щоб зробити рухи джгутика все більш активними. При наближенні до яйцеклітини вже відкриті майже всі канали, тому кальцій виконує й іншу свою роль – злиття пухирця-везикули акросоми з мембраною сперматозоїда й викидання його вмісту. Акросомна реакція вимагає участі багатьох білків ендоцитозу (викидання клітиною вмісту своїх везикул назовні), які є кальцій-залежними.

Тепер ми знаємо, чому порушення хоча б одного з семи компонентів «електричного кота» CatSper призводить до дисфункції сперматозоїда та неможливості запліднення. Проте іонних каналів у сперматозоїді відкрито ще десятки. Серед них кальцієві, калієві, протонні канали і такі неочікувані як холодовий рецептор та больові рецептори. Яка їхня роль? Чи можна знайти такі фармакологічні блокатори іонних каналів сперматозоїда, які б могли стати небар'єрними чоловічими контрацептивами? Над цими питаннями продовжує працювати лабораторія Поліни Лішко та десятки інших біофізиків, клітинних біологів, фармакологів.

А що там з іонними каналами яйцеклітини? Про це ми поговоримо якимось наступним разом.