КАРІОТИПУВАННЯ

Види і клінічне значення

З кожним днем цитогенетична діагностика з методу ноу-хау все більше перетворюється на звичайне рутинне досідження. І кожному сучасному лікарю гінекологу необхідно знати основні покази, методи та принципи проведення таких досліджень. Саме з цією метою публікуємо даний матеріал, що допоможе кожному з практикуючих акушерів-гінекологів освіжити свої знання з медичної генетики та отримати інформацію щодо основ цитогенетичної діагностики

Поняття та визначення

Ген – це лінійна ділянка молекули ДНК, яка несе в собі інформацію про формування якоїсь певної ознаки.

Послідовно розташовані гени формують молекулу ДНК.  Зв’язані з білками ядра молекули ДНК формують хромосоми.

У цих структурах зосереджена більша частина спадкової інформації. Саме вони зберігають, реалізують і передають її наступному поколінню.

Особливістю хромосом є те, що вони чітко видимі у світловому мікроскопі лише у період поділу клітини.

Каріотип – сукупність ознак (число, морфологія та ін.) повного набору хромосом, яка притаманна клітинам даного організму або лінії клітин (клон).

Каріотипування – цитогенетичний метод, який дозволяє виявляти відхилення в структурі та кількості хромосом.

Цей метод дослідження дає можливість виключити хромосомні аномалії та встановити каріотип наданого генетичного матеріалу.

Методи цитогенетики

В основі цитогенетичного дослідження лежить отримання із ядер соматичних клітин (як правило, лімфоцитів крові), зафіксованих на предметному склі хромосом, їх диференційне пофарбування по довжині та аналіз у світловому мікроскопі..

Техніка диференційного пофарбування хромосом (GTG-бендінг) – найбільш поширена у діагностичній практиці.

GTG-бендінг – це метод фарбування хромосом з використанням трипсину за методом Гімза (G-bands by Тrypsin using Giemsa). Внаслідок цього хромосоми набувають характерного смугастого вигляду.

Далі оцінюються наступні характеристики:

• кількість хромосом;
• морфологія хромосом;
• розташування смуг на кожній із хромосом.

Метод FISH (флуоресцентна гібридизація in situ) – метод молекулярної цитогенетики, за допомогою якого ідентифікується конкретна хромосома або її певна частина. Перевагою методу FISH є те, що він надає можливість діагностувати ті незначні перебудови у хромосомах, які не виявляються традиційними цитогенетичними методами.

Метод FISH – це метод візуалізації хромосом з використанням набору флуоресцентних ДНК-зондів. Зонди знаходять комплементарні частини ДНК, з’єднуються з ними і за наявністю чи відсутністю флуоресцентного сигналу можна зробити висновок про наявність і локалізацію конкретного локусу хромосоми.

Метод GTG-бендінгу дає більш загальну картину про будову хромосомного апарату, метод FISH дозволяє виявити конкретні зміни в будові. Тому при спрямуванні на каріотипування методом FISH-гібридизації необхідно вказувати, які саме аномалії підозрює лікар.

Для клінічної генетики мають значення три основних типи каріотипування:

1. Визначення каріотипу пацієнта (постнатальне каріотипування);
2. Дослідження хромосом плода (пренатальне каріотипування);
3. Визначення каріотипу абортусу.

Визначення каріотипу пацієнта

У нормі каріотип людини складається із 46 хромосом – 22 пари аутосом та дві статеві хромосоми: жіночий каріотип – 46,ХХ, чоловічий каріотип – 46,ХY.

Хромосомні синдроми –це захворювання, які зумовлені змінами у кількості (анеуплоїдії) чи у структурі (делеції, транслокації, інверсії, дуплікації та ін.) окремих хромосом у каріотипі пацієнта. Хромосомні синдроми виникають у результаті мутацій у статевих клітинах батьків або можуть передаватись від батьків-носіїв збалансованих хромосомних перебудов дітям. Частота хромосомних аномалій серед новонароджених складає 5–7 на 1000, але у групах дітей із затримкою розумового розвитку — 8–20%, за даними різних авторів.

Практично всі хромосомні синдроми характеризуються:

• різними нервово-психічними розладами;
• множинними вродженими вадами розвитку (МВВР) різних систем та органів, порушенням статевого розвитку;
• різними стигмами дизембріогенезу (незначні анатомічні відхилення);
• відставанням у рості та розвитку (пренатальне або постнатальне).

Частота хромосомних аномалій, які виявляються в групі пацієнтів з проблемами репродукції, складає 4–5%, а у групі чоловіків з порушенням сперматогенезу вона може сягати 13–15%. Молекулярно-цитогенетична діагностика для пацієнтів, перед лікуванням методами ДРТ, спрямована на виключення хромосомної патології чи носійства збалансованих хромосомних перебудов у фенотипово здорового подружжя, а значить, – на профілактику виникнення хромосомної патології у їхніх майбутніх дітей. Крім того, вона допомагає лікарям визначитись з методом лікування непліддя і є обов’язковою донорам яйцеклітин та сперми.

Показання для спрямування на визначення каріотипу пацієнта:

• МВВР (множинні вроджені вади розвитку);
• розумова відсталість;
• порушення статевого розвитку;
• непліддя (первинне або вторинне);
• звичне невиношування вагітності;
• мертвонародження чи народження дитини з МВВР у анамнезі;
• чоловічий фактор непліддя (в тому числі, порушення сперматогенезу).

Підготовка до дослідження

• виключити з раціону харчування пацієнта жирне, смажене, алкоголь за 1–2 дні до дослідження;
• виключити прийом антибіотиків, хіміотерапевтичних, гормональних препаратів та ін. за 2 тижні до дослідження;
• забір матеріалу у хворих на ГВРЗ проводиться не раніше, ніж за 14 діб після одужання.

Матеріал для дослідження

• венозна кров об’ємом 2 мл, набрана в моновет (Sarstedt Monovette, Li-Heparin LH/2.7ml).

Після забору кров необхідно ретельно перемішати, а сам моновет промаркувати (П.І.П, Дата народження, дата та час забору).

Умови доставки матеріалу

• збереження температурного режиму (t° 4–8°С);
• доставка в лабораторію протягом доби від моменту забору

Дослідження хромосом плода (пренатальне каріотипування)

Пренатальним скринінгом називаються дослідження, що проводяться вагітним жінкам з метою формування груп ризику ускладнень вагітності. Окремим видом пренатального скринінгу є скринінг щодо виявлення груп ризику розвитку вроджених вад та хромосомної патології у плода. Скринінг не дозволяє виявити усіх жінок, у яких може бути та чи інша проблема, але дає можливість виділити відносно невелику групу пацієнток, всередині якої буде зосереджена більша частина осіб з даним видом патології.

За видами досліджень виділяють:

• біохімічний скринінг (аналіз крові на різні показники);
• ультразвуковий скринінг (виявлення ознак аномалій розвитку за допомогою УЗД);
• комбінований скринінг (поєднання біохімічного та ультразвукового скринінгів).

За результатами цих скринінгів може бути рекомендована вагітній інвазивна пренатальна діагностика з метою виключення хромосомної патології у плода.

Біопсія ворсин хоріона дозволяє у короткий термін (1–2 доби) провести дослідження хромосомного набору плода і генних мутацій в 11–12 тижнів вагітності.

Біопсія ворсин плаценти – метод, аналогічний біопсії хоріону, тому що плацента – це те, у що з часом розвивається хоріон, однак проводиться у більш пізні терміни — 12–22 тижні вагітності. При проведенні біопсії хоріона/плаценти є незначний ризик хибнопозитивних або хибнонегативних результатів, що пояснюється явищем «плацентарного мозаїцизму» – не ідентичності геному клітин ембріона і хоріона/плаценти.

Амніоцентез – це спосіб отримання навколоплідної рідини. Результат аналізу після амніоцентезу буває готовий через 2–3 тижні.

Кордоцентез – це пункція судин пуповини плода. Ця процедура має найвищу точність, але й найвищий ризик (4–5%). Забір матеріалу проводиться шляхом проколу передньої черевної стінки вагітної (під контролем УЗД) і отримання пуповинної крові.

Дослідження проводять після 20-го тижня вагітності. За умови дотримання всіх норм і правил проведення інвазивної діагностики основний ризик перерахованих процедур – загроза викидня. У кількісному значенні він дорівнює 1–3%. Але ці показники не перевищують ризик виникнення тієї ж проблеми у інших вагітних.

Пренатальна інвазивна діагностика спрямована на виключення хромосомної патології у плода. Якщо рівень хромосомних аномалій, який виявляється у плода, у групі вагітних жінок високого ризику, >5%, це вважається хорошим показником даного скринінгу.

Показання для діагностики

• вік жінки понад 35 років;
• наявність у сім'ї дитини (плода) з хромосомною хворобою або множинними вадами розвитку;
• наявність у батьків хромосомної патології, хромосомної перебудови або генних мутацій (для яких картований ген);
• моногенні хвороби, що раніше діагностовані у родині або у найближчих родичів (для яких картований ген);
• виявлення ультразвукових маркерів хромосомних хвороб у плода;
• позитивні результати біохімічного скринінгу в I або II триместрі вагітності.

Підготовка до дослідження

Слід враховувати, що на результати досліджень може впливати прийом вагітною лікарських препаратів (антибіотиків, імуносупресивних, хіміотерапевтичних, гормональних препаратів, антикоагулянтів та ін.)

Матеріал для дослідження:

• біоптат ворсин хоріону/плаценти;
• навколоплідні води;
• пуповинна кров.

Для правильного набору матеріалу, перед проведенням інвазивної процедури шприц необхідно промити розчином гепарину (у співвідношенні гепарин/фіз. розчин 1:9).

Необхідно пам’ятати, що на достовірність результатів досліджень впливає кількість взятого у ході процедури біологічного матеріалу: біоптату ворсин хоріону/плаценти не менше 25–30 мг, навколоплідних вод – не менше 15 мл (для 15–16 тиж.)/20 мл (19–20 тиж.), пуповинної крові – не менше 1,5–2 мл.

При індивідуальному низькому мітотичному індексі культури клітин вагітній жінці може бути запропонований повторний забір матеріалу.

До направлення на обстеження необхідно обов’язково додати всі попередні дані генетичного анамнезу подружньої пари.

Ємності з біоматеріалом слід ретельно промаркувати (П.І.П, дата народження, дата та час забору)

Умови доставки матеріалу

• збереження температурного режиму (t° 4–8°С);
• доставка в лабораторію протягом доби від забору.

Матеріал доставляється у лабораторію або у стерильному шприці, або в іншій стерильній герметично закритій ємкості: навколоплідні води чи пуповинна кров – в нативному стані, ворсин хоріону/плаценти – у тому розчині (культуральне середовище/фізрозчин), у який проводилась аспірація.

Визначення каріотипу абортусу

Абортуc (Abortus, лат.)  – продукт аборту, який був вивільнений з матки мертвим або нездатним до самостійного виживання. З'ясування причин невиношування вагітності є досить важким завданням. Етіологічними факторами спонтанних абортів можуть бути ендокринопатії матері, аутоімунні ускладнення (антифосфоліпідний синдром, HLA-несумісність і т. д.), аномалії розвитку внутрішніх статевих органів, інфекції, застосування гормональних контрацептивів, вплив навколишнього середовища і багато інших.

У період ембріонального розвитку у людини гине близько половини всіх зачать і не менш, ніж у половині випадків загибель ембріонів відбувається через хромосомні порушення: значна частина елімінується до імплантації, а з клінічно розпізнаних вагітностей близько 15–20% гине в першому триместрі.

У 0,5–1% випадків після першого викидня настає другий, третій і пацієнтка переходить у категорію хворих зі звичним невиношуванням вагітності і, не виключено, що генетичні фактори у цій групі жінок виявляються домінуючими. Після кількох спроб самостійно завагітніти подружжя звертаються у клініки, де для лікування безпліддя використовуються допоміжні репродуктивні технології (ДРТ).

Однак у програмі екстракорпорального запліднення (ЕКЗ), близько 10% вагітностей так само виявляються тими, що не розвиваються і у підсумку закінчуються самоабортом.

Тому, у кожному випадку самоаборту, для правильного планування наступної вагітності і вироблення тактики її ведення набуває актуальності можливість з'ясування ймовірної причини його виникнення.

Показання для діагностики

• завмерла повторно вагітність у терміні до 12-ти тижнів.

Матеріал для дослідження

• весь біоматеріал, отриманий після переривання вагітності.

Умови доставки матеріалу

• збереження температурного режиму (t° 4–8°С);
• доставка в лабораторію протягом доби від забору.

Біоматеріал повинен бути доставлений у нативному стані (не зафіксований, не заморожений, не висушений); доставлений у стерильній ємності з доданням незначної кількості фізіологічного розчину.

До направлення обов’язково слід додати всі попередні дані генетичного анамнезу подружньої пари.

Ємності з біоматеріалом необхідно промаркувати (П.І.П пацієнта, дата народження, дата та час забору).